鈍化NF-κB的活化對哮喘大鼠肺組織MIF及血清IL-4的影響

朱惠源，薛永志，閆少峰

(1.包頭醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，內(nèi)蒙古 包頭 014060，2.包頭市中心醫(yī)院呼吸內(nèi)科，內(nèi)蒙古包頭 014040)

支氣管哮喘是一種炎性氣道高反應(yīng)性疾病，其發(fā)病機制至今仍未完全闡明，可能與多種炎性細胞、炎癥介質(zhì)和以Th2型淋巴因子為主的細胞因子網(wǎng)絡(luò)參與的慢性變應(yīng)性炎癥反應(yīng)有關(guān)。以往的研究表明［1－3］，巨噬細胞移動抑制因子(MIF)和 NF-κB 均參與了哮喘的疾病進程。而IL-4是哮喘炎癥反應(yīng)中Th2淋巴細胞分泌，促進IgE介導(dǎo)的免疫應(yīng)答反應(yīng)，還能促進血管內(nèi)皮細胞黏附分子的表達從而導(dǎo)致嗜酸粒細胞在炎癥部位的選擇性聚集，導(dǎo)致氣道炎癥［2］。柳氮磺胺吡啶(SASP)為治療炎癥性腸病的主要藥物，具有抗炎抗免疫作用，并可作為NF-κB的特異性抑制劑［4－5］。本研究觀察哮喘大鼠肺組織中MIF、NF-κB及血清IL-4水平變化，并使用工具藥SASP鈍化NF-κB的活化，探討對MIF、IL-4和哮喘的影響，揭示其在支氣管哮喘發(fā)病機制中的作用及其環(huán)節(jié)，為支氣管哮喘的藥物治療提供新的靶點和研究方向。

1 材料與方法

1.1動物清潔級♀Wistar大鼠40只，體質(zhì)量180～230 g，購自河南省實驗動物中心，實驗動物許可證號:SCXK(豫)2005-0001。

1.2主要試劑卵蛋白(OVA，Ⅱ級，Sigma公司，A5253);氫氧化鋁分析純(天津金匯太亞化學(xué)試劑有限公司);柳氮磺吡啶結(jié)腸溶膠囊(潮州市強基制藥廠，批號:100505);地塞米松針劑(鄭州卓峰制藥有限公司，批號:08121957);兔抗大鼠 MIF、NF-κB p65多克隆抗體、SABC試劑盒、DAB顯色劑、大鼠IL-4 ELISA試劑盒(武漢博士德公司)。

1.3方法

1.3.1動物分組和模型建立大鼠于動物房(環(huán)境溫度20℃ ～25℃，相對濕度50% ～70%)適應(yīng)飼養(yǎng)1周后造模。造模方法依據(jù)文獻報道進行［6］。按隨機數(shù)字表分為4組，每組10只。A組(哮喘模型組):大鼠于d 1腹腔注射1 ml含有OVA 100 mg和氫氧化鋁100 mg的生理鹽水溶液進行致敏，自d15開始，將大鼠置于密閉容器內(nèi)，以1%OVA生理鹽水溶液霧化吸入激發(fā)哮喘，每次30 min，每天1次，連續(xù)7 d;B組(柳氮磺胺吡啶組):以同樣方法致敏和激發(fā)大鼠，并于每次激發(fā)前30 min腹腔注射SASP生理鹽水溶液(250 mg×2粒溶入10 ml NS中，配制成濃度為50 g·L－1的混懸液，超聲助溶，每日投藥量按成人70 kg體質(zhì)量與大鼠200 g體質(zhì)量1∶0.018比例，給藥劑量300 mg·kg－1);C組(地塞米松組):以同樣方法致敏和激發(fā)大鼠，并于每次激發(fā)前30 min腹腔注射地塞米松(1 mg·kg－1);D組(空白對照組):以生理鹽水代替OVA注射致敏和霧化激發(fā)，余同模型組。

1.3.2取材各組于最后一次霧化激發(fā)后24 h麻醉處死，取肺左葉置于10%中性福爾馬林液中固定12 h后，常規(guī)石蠟包埋切片，以備進行常規(guī)HE染色和免疫組化實驗;腹主動脈取血，室溫凝固2 h后，低溫離心2 000×g15 min，分離血清并冷凍于－20℃以備進行血清IL-4含量測定。

1.3.3肺組織免疫組化分析MIF及NF-κB蛋白表達的檢測參照免疫組化試劑盒說明書執(zhí)行，一抗稀釋度均為1∶100。PBS代替一抗作為陰性對照，切片染色中出現(xiàn)棕黃色為陽性表達。每張大鼠切片隨機選取5支中小支氣管高倍視野，采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件，分別計算每支中小支氣管陽性染色區(qū)域的平均光密度值(MOD)，以所有小支氣管平均光密度值的均值作為該大鼠切片的蛋白表達值［7－8］。

1.3.4ELISA方法檢測血清IL-4水平按照ELISA檢測試劑盒說明書操作，TMB顯色劑孔為空白對照孔，大鼠血清樣品直接加樣，按程序添加一抗、ABC及TMB顯色劑，終止顯色后立即使用酶標(biāo)儀讀取每孔的吸光度(OD)值。通過CurveExpert 1.3軟件獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算每只大鼠血清的IL-4濃度值。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理所有數(shù)據(jù)采用±s表示，利用SPSS 13.00統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，經(jīng)正態(tài)性分布及方差齊性檢驗后進行單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。

2 結(jié)果

2.1病理學(xué)檢查模型組可見各級支氣管周圍炎性細胞大量浸潤、管腔痙攣狹窄、黏膜上皮細胞水腫、脫落，多見黏液栓，肺組織中炎性細胞浸潤明顯，肺泡間隔增寬;B組和C組各級支氣管周圍炎性細胞浸潤數(shù)量明顯減少，管腔痙攣狹窄減輕，黏液栓減少，肺組織炎細胞浸潤減輕。正常對照組各級支氣管黏膜上皮完整，未見上皮細胞水腫、脫落，管腔無痙攣狹窄，肺組織中未見明顯炎性細胞浸潤，肺泡間隔正常，見Fig 1。

Fig 1 Pathological changes in lung in different groups (HE strains，×200)

2.2MIF、NF-κB免疫組化結(jié)果分析A組可見深棕黃色強陽性表達，陽性區(qū)域主要位于各級支氣管黏膜上皮和黏膜下層;B組和C組可見棕黃色陽性表達，主要位于各級支氣管黏膜上皮和黏膜下層;D組支氣管黏膜上皮和黏膜下層可見弱陽性表達。A組肺組織中 MIF、NF-κB的表達高于 D組(P＜0.05);B組、C組肺組織中MIF、NF-κB的表達低于A組(P均＜0.05);B組和C組之間MIF、NF-κB的表達差異無顯著性(P＞0.05)。對 NF-κB、MIF蛋白表達與血清IL-4水平進行相關(guān)性分析，NF-κB與MIF蛋白表達之間具有高度相關(guān)性(r=0.94，P＜0.01);NF-κB蛋白表達與血清IL-4水平之間具有高度相關(guān)性(r=0.73，P＜0.01);MIF蛋白表達與血清IL-4水平之間具有高度相關(guān)性(r=0.71，P＜0.01)。各組肺組織MIF、NF-κB表達免疫組化檢測結(jié)果如Tab 1，各組肺組織MIF、NF-κB表達免疫組化染色見 Fig 2、3。

2.3血清IL-4水平ELISA檢測結(jié)果模型組血清IL-4水平高于正常對照組(P＜0.05);SASP組和DXM組血清IL-4水平低于模型組(P均＜0.05);SASP組和DXM組之間血清IL-4水平差異無顯著性(P＞0.05)。各組IL-4檢測的濃度值結(jié)果如Tab 1。

Tab 1 MOD of lung tissue MIF，NF-κB p65 expression and IL-4 level in serum in each group(±s，n=10)

Tab 1 MOD of lung tissue MIF，NF-κB p65 expression and IL-4 level in serum in each group(±s，n=10)

A:Asthmatic model;B:Sulfasalazine;C:Dexamethasone;D:Control.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs asthma;△P＜0.05 vs Asthma+DXM

Group MIF(MOD)MOD IL-4 concentration/ng·L －1 A 0.220 ±0.013* 0.171 ±0.009* 25.70 ±7.61*B 0.166 ±0.011#△ 0.137 ±0.004#△ 11.73 ±5.94#△C 0.158 ±0.008# 0.132 ±0.004# 8.49 ±3.33#D 0.097 ±0.003 0.106 ±0.006 5.98 ±4.02

Fig 2 Expression of MIF protein in lung in different groups by immunohistochemistry(immunohistochemistry strains，×200)

Fig 3 Expression of NF-κB protein in lung in different groups by immunohistochemistry(immunohistochemistry strains，×200)

3 討論

大鼠哮喘模型的制備，通常的方法是采用兩次致敏法(第1次致敏后1周再次OVA腹腔注射致敏1次)，但我們的實驗采用吳巧珍等［6］介紹的模型制備方法，僅進行1次致敏，病理結(jié)果顯示，我們的大鼠哮喘模型與兩次致敏模型具備同樣效果，表明模型制備成功。

MIF是作用廣泛的前炎癥因子和促炎因子，可拮抗糖皮質(zhì)激素的作用，促進多種炎性因子的表達［9］。Mizue 等［2］的研究顯示，MIF－/－哮喘小鼠肺組織中IL-4、IL-5、IL-13 mRNA及其蛋白表達明顯低于MIF+/+哮喘小鼠，可見MIF可上調(diào)哮喘中Th2細胞因子的表達。NF-κB作為一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子，參與了多種炎癥蛋白基因的轉(zhuǎn)錄［10］。研究表明，這兩種因子均可促進Th2型細胞因子的表達，加重哮喘病程［1－3］。在我們的實驗結(jié)果中顯示，MIF和NF-κB在哮喘大鼠肺組織中明顯表達，血清IL-4升高，與先前的研究一致。以往對MIF和NF-κB的關(guān)系研究表明［11］，MIF可抑制糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的IκB的合成，從而使NF-κB轉(zhuǎn)位至核內(nèi)導(dǎo)致目的基因轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生相關(guān)的炎性因子;另有研究表明［12］，TNF-α可通過激活NF-κB途徑刺激子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞MIF的基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達，從而加重炎癥反應(yīng)?？梢娫贛IF和NF-κB的關(guān)系中存在著正反饋機制，兩者相互促進，進一步加重了炎癥反應(yīng)。因此，MIF和NF-κB或成為哮喘進程中重要的治療靶點。

SASP具有抗菌、抗炎和免疫抑制等效應(yīng)，主要用于炎癥性腸病的治療，Olmez等［13］對其在哮喘的應(yīng)用中顯示，SASP干預(yù)可使哮喘小鼠氣道組織病理學(xué)參數(shù)獲得明顯改善，對基底膜厚度的改善優(yōu)于地塞米松組。據(jù)以往的研究顯示［4］，SASP是 NF-κB的特異性抑制劑，Weber等［14］的研究進一步提示，SASP可通過直接抑制lκB激酶的活性，抑制lκB的磷酸化及其降解，從而抑制NF-κB的活化。在我們的實驗中，經(jīng)SASP干預(yù)后，大鼠肺組織中MIF和NF-κB的表達較模型組減輕，血清IL-4水平下降，組織病理學(xué)結(jié)果也改善，與DXM的作用差異無顯著性，表明SASP抑制哮喘的機制之一有可能是通過對MIF和NF-κB的抑制作用。因此我們進一步推測，SASP可能是通過鈍化NF-κB的活化，間接地抑制了MIF的基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達，減輕了MIF對糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的IκB合成的抑制作用，從而抑制了NF-κB和MIF介導(dǎo)的包括IL-4在內(nèi)的多種Th2細胞因子的生成和活化，從而減輕哮喘的炎癥反應(yīng)。

目前，有關(guān)SASP對哮喘影響的研究較少，我們的實驗提示，SASP對哮喘具有抑制作用，其可能是通過抑制 NF-κB、MIF而實現(xiàn)的。因此，對于 NF-κB、MIF等重要治療靶點的研究，具有重要的指導(dǎo)意義，將為哮喘發(fā)病機制的深入研究以及臨床治療提供新的思路和方法。

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