小檗堿對(duì)糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松大鼠松質(zhì)骨和皮質(zhì)骨的影響

許碧蓮，徐道華，陳文雙，崔 燎

(廣東醫(yī)學(xué)院1.藥理教研室、2.廣東天然藥物研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東湛江 524023)

糖皮質(zhì)激素具有抗炎、免疫抑制與抗過敏、抗休克等作用，臨床上用于嚴(yán)重感染或炎癥、自身免疫性疾病、過敏性疾病、呼吸系統(tǒng)疾病等，但長(zhǎng)期應(yīng)用可導(dǎo)致骨質(zhì)疏松，增加骨折發(fā)生率［1］。如何防治糖皮質(zhì)激素誘發(fā)骨質(zhì)疏松(glucocorticoid induced osteoporosis，GIOP)，是目前各學(xué)者研究的重點(diǎn)課題之一。小檗堿(berberine，BBR)又稱黃連素，是一種異喹啉類生物堿，可從中草藥黃連、黃柏中提取的化合物，具有抗炎、抗腫瘤、抗消化性潰瘍、降血糖和調(diào)血脂等作用［2－3］。本課題組前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示［4］，小檗堿可防治糖皮質(zhì)激素誘發(fā)的大鼠脛骨上段松質(zhì)骨的骨丟失，但對(duì)腰椎松質(zhì)骨和脛骨中段皮質(zhì)骨是否也有防治作用，尚未進(jìn)一步的研究。本文通過骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)方法探討小檗堿對(duì)糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松大鼠腰椎松質(zhì)骨和脛骨中段皮質(zhì)骨的作用，并探討其作用機(jī)制，為把小檗堿開發(fā)成抗骨質(zhì)疏松藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1藥品及儀器小檗堿購自Sigma公司;醋酸潑尼松購自浙江仙琚制藥股份有限公司;碳酸鈣維D片(每片含碳酸鈣750 mg，維生素D3100 U)購自美國(guó)安士制藥公司;鹽酸四環(huán)素、鈣黃綠素、Goldner’s染料購自美國(guó)Sigma公司。低速鋸(Buehler LTD，USA);硬組織切片機(jī)(德國(guó)Leica 2155);碳化鎢剛刀(德國(guó)Leica);自動(dòng)化圖像數(shù)字化分析儀包括光鏡和熒光顯微鏡(Nikon，日本);骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)測(cè)量軟件(KSS Scientific Consultants，USA)。

1.2動(dòng)物及其分組3月齡♂ SD大鼠共60只(SPF級(jí)，廣東醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，體質(zhì)量(270±15)g。大鼠隨機(jī)分成6組:正常對(duì)照(CON)組、潑尼松(Pred)組、潑尼松加碳酸鈣維D(Pred+Ca+VitD)組、潑尼松加小檗堿低劑量〔Pred+BBR(L)〕組、小檗堿中劑量〔Pred+BBR(M)〕組、小檗堿高劑量〔Pred+BBR(H)〕組，每組10只。CON組給予溶劑對(duì)照溶液，其它5組先用潑尼松3.5 mg·kg－1·d－1造模，1 h 后再分別給予溶劑對(duì)照溶液、碳酸鈣 375 mg·kg－1·d－1及維生素 D350 U·kg－1·d－1、BBR 15、30、60 mg·kg－1·d－1。大鼠每次按 5 ml·kg－1灌胃給藥，連續(xù)給藥12周。每周稱體重1次，并按體重變化調(diào)整給藥量。所有動(dòng)物在處死前d 14、13和d 4、3分別皮下注射鈣黃綠素7.5 mg·kg－1進(jìn)行體內(nèi)熒光標(biāo)記。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，大鼠麻醉后心臟抽血處死，迅速取出左側(cè)脛骨及第5腰椎，以備進(jìn)行下列骨形態(tài)計(jì)量學(xué)的測(cè)定。

1.3骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)測(cè)定取第5腰椎，用低速鋸暴露骨髓腔，進(jìn)行固定、脫水、包埋，按文獻(xiàn)［5］制成 5 μm 和 8 μm 切片，5 μm 骨薄片采用 Masson-Goldner-Trichrome染色，染色后測(cè)量骨形態(tài)計(jì)量學(xué)靜態(tài)參數(shù)和吸收參數(shù)，8 μm骨厚片直接封片測(cè)量有關(guān)動(dòng)態(tài)參數(shù)，然后按公式［6］計(jì)算出相應(yīng)的參數(shù)。取脛骨中段進(jìn)行固定、脫水、包埋，按文獻(xiàn)［7］制成40 μm左右的骨片，然后測(cè)量皮質(zhì)骨有關(guān)動(dòng)靜態(tài)參數(shù)，按公式［6］計(jì)算出相應(yīng)的參數(shù)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)量資料以±s表示，SPSS11.5軟件行方差分析并行組間比較。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠腰椎松質(zhì)骨的變化

2.1.1各組大鼠腰椎松質(zhì)骨靜態(tài)和吸收參數(shù)的變化與 CON組比較，Pred組腰椎骨小梁厚度(Tb.Th)降低(P＜0.05)，吸收參數(shù)每毫米破骨細(xì)胞數(shù)(Oc.N)、破骨細(xì)胞貼壁周長(zhǎng)(Oc.S.Pm)均增加(P＜0.05)，但骨小梁數(shù)量(Tb.N)、骨小梁分離度(Tb.Sp)無明顯變化(P＞0.05)。與Pred組比較，碳酸鈣維D和小檗堿3個(gè)劑量使Tb.Th增加(P＜0.05)，使Oc.N和Oc.S.Pm降低(P＜0.05)。小檗堿3個(gè)劑量組之間差異無顯著性(P＞0.05)。見Tab 1。

與CON組比較，Pred組大鼠腰椎松質(zhì)骨的骨量減少，碳酸鈣維D和小檗堿可預(yù)防潑尼松所致骨量的減少。見Fig 1。

2.1.2各組大鼠腰椎松質(zhì)骨動(dòng)態(tài)參數(shù)的變化與CON組比較，Pred組腰椎標(biāo)記周長(zhǎng)百分?jǐn)?shù)(%L.Pm)、骨礦化沉積率(MAR)、3種骨形成率(BFR/TV、BFR/BV、BFR/BS)均降低(P＜ 0.05，P＜0.01)。與Pred組比較，碳酸鈣維D和小檗堿3個(gè)劑量使動(dòng)態(tài)參數(shù)均增加(P＜0.05，P＜0.01)。小檗堿中劑量組%L.Pm、BFR/TV、BFR/BV、BFR/BS較CON組增加明顯，但與低劑量組和高劑量組之間差異無顯著性(P＞0.05)。見Tab 2。

2.1.3各組大鼠腰椎生長(zhǎng)板縱向生長(zhǎng)熒光標(biāo)記的變化與CON組比較，Pred組腰椎生長(zhǎng)板熒光標(biāo)記間距縮小。碳酸鈣維D和小檗堿3個(gè)劑量可預(yù)防潑尼松所致腰椎生長(zhǎng)板熒光標(biāo)記間距縮小。見Fig 2。

2.2各組大鼠脛骨中段皮質(zhì)骨的變化

2.2.1各組大鼠脛骨中段皮質(zhì)骨靜態(tài)參數(shù)的變化與CON組比較，Pred組脛骨中段骨組織總面積(T.Ar)、皮質(zhì)骨面積(Ct.Ar)均減少(P＜0.05)，但骨髓腔面積(Ma.Ar)、皮質(zhì)骨面積百分?jǐn)?shù)(%Ct.Ar)和骨髓腔面積百分?jǐn)?shù)(%Ma.Ar)無變化(P＞0.05)。與Pred組比較，碳酸鈣維D組和小檗堿3個(gè)劑量組均無變化(P＞0.05)。見Tab 3。

2.2.2各組大鼠脛骨中段皮質(zhì)骨的動(dòng)態(tài)變化與CON組比較，Pred組皮質(zhì)骨的骨外膜的熒光減少。碳酸鈣維D和小檗堿3個(gè)劑量對(duì)皮質(zhì)骨均無影響。見Fig 3。

Fig 1 Micrographs of the sagittal section of fifth lumbar vertebrae(LV5)in different groups of rats(Goldner’s Trichrome staining ×10)

Fig 2 Micrographs of interlabeled width of growth plate of LV5 in different groups of rats(×100)

Tab 1 The changes of static and absorption parameters of LV5 in rats in each group(±s，n=10)

Tab 1 The changes of static and absorption parameters of LV5 in rats in each group(±s，n=10)

*P＜0.05 vs control;△P＜0.05 vs Pred

Group Tb.N/No.·mm －1 Tb.Th/μm Tb.Sp/μm Oc.N/No.·mm －1Oc.S.Pm/%Control 3.3 ±0.4 94.3 ±13.4 211.9 ±22.5 0.16 ±0.04 0.31 ±0.10 Pred 3.2 ±0.3 82.3 ±6.0* 230.1 ±29.8 0.38 ±0.06* 0.58 ±0.11*Pred+Ca+VitD 3.1 ±0.4 104.8 ±15.3△ 223.2 ±39.1 0.21 ±0.06△ 0.33 ±0.11△Pred+BBR(L)3.2 ±0.2 102.8 ±15.3△ 211.6 ±20.1 0.21 ±0.05△ 0.34 ±0.10△Pred+BBR(M)3.2 ±0.4 100.9 ±19.4△ 214.8 ±25.1 0.20 ±0.05△ 0.33 ±0.11△Pred+BBR(H)3.2 ±0.3 98.4 ±11.3△ 219.2 ±26.6 0.20 ±0.06△ 0.32 ±0.13△

Tab 2 The changes of dynamic parameters of LV5 in rats in each group(±s，n=10)

Tab 2 The changes of dynamic parameters of LV5 in rats in each group(±s，n=10)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control;△P＜0.05，△△P＜0.01 vs Pred

Group %L.Pm/% MAR/μm·d－1 BFR/TV/%·year－1 BFR/BV/%·year－1 BFR/BS/%·year －1 Control 6.15 ±2.11 1.17 ±0.13 14.17 ±4.50 45.82 ±13.41 2.59 ±0.86 Pred 1.83 ±1.22＊＊ 1.02 ±0.11* 3.62 ±2.46＊＊ 13.73 ±10.58＊＊ 0.68 ±0.49＊＊Pred+Ca+VitD 4.79 ±1.43△ 1.14 ±0.11△ 10.39 ±4.22△△ 34.17 ±13.38△△ 2.00 ±0.68△△Pred+BBR(L)4.05 ±1.08△ 1.05 ±0.18 8.35 ±2.40△△ 26.21 ±8.44△ 1.56 ±0.43△△Pred+BBR(M)7.11 ±1.89△△ 1.26 ±0.09△ 17.36 ±4.25△△ 58.78 ±14.59△△ 3.28 ±0.92△△Pred+BBR(H)5.32 ±2.73△ 1.18 ±0.17△ 12.29 ±6.93△△ 39.96 ±23.95△△ 2.36 ±1.46△△

Tab 3 The changes of static paramerers of Tx in rats in each group(±s，n=10)

Tab 3 The changes of static paramerers of Tx in rats in each group(±s，n=10)

*P＜0.05 vs control

Group T.Ar/mm2 Ct.Ar/mm2 Ma.Ar/mm2%Ct.Ar/% %Ma.Ar/%Control 6.06 ±0.31 4.93 ±0.25 1.10 ±0.14 81.94±1.87 18.06 ±1.87 Pred 5.61 ±0.36* 4.55 ±0.39* 1.06 ±0.16 80.98 ±2.94 19.02 ±2.94 Pred+Ca+VitD 5.72 ±0.57 4.64 ±0.40 1.08 ±0.25 81.31 ±2.94 18.69 ±2.97 Pred+BBR(L)5.92 ±0.53 4.80 ±0.49 1.12 ±0.14 81.01 ±2.08 18.98 ±2.08 Pred+BBR(M)5.62 ±0.43 4.55 ±0.33 1.08 ±0.16 80.93 ±2.00 19.07 ±2.00 Pred+BBR(H)5.78 ±0.29 4.68 ±0.30 1.07 ±0.09 81.30 ±1.72 18.70 ±1.72

Fig 3 Micrographs of the dynamic changes of the tibial shaft(Tx)in different groups in rats(×40)

3 討論

骨質(zhì)疏松癥是以骨量減少、骨的微觀結(jié)構(gòu)退化為特征，致使骨的脆性增加，易發(fā)生骨折的一種全身性骨骼疾病。骨質(zhì)疏松癥分為原發(fā)性、繼發(fā)性和特發(fā)性骨質(zhì)疏松。繼發(fā)性骨質(zhì)疏松是由其它疾病或藥物等因素誘發(fā)的骨質(zhì)疏松，GIOP是最常見的繼發(fā)性骨質(zhì)疏松，其發(fā)病率僅次于絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松及老年性骨質(zhì)疏松而居第3位，GIOP患者受到輕微外力骨折的風(fēng)險(xiǎn)增加30%～40%，發(fā)生骨折的部位主要在腰椎及髖骨等。

由Tab 1和Fig 1的結(jié)果可見，潑尼松組大鼠腰椎松質(zhì)骨的骨量減少，骨小梁厚度降低，但每毫米破骨細(xì)胞數(shù)、破骨細(xì)胞貼壁周長(zhǎng)均增加。由Tab 2的結(jié)果可見，潑尼松組腰椎松質(zhì)骨標(biāo)記周長(zhǎng)百分?jǐn)?shù)、骨礦化沉積率、骨形成率均降低。由Fig 2的結(jié)果可見，潑尼松組腰椎生長(zhǎng)板縱向生長(zhǎng)熒光標(biāo)記間距明顯縮小。結(jié)果提示，潑尼松既抑制大鼠腰椎松質(zhì)骨的骨形成和骨礦化，又促進(jìn)骨吸收，但以抑制骨形成為主，導(dǎo)致松質(zhì)骨的丟失。糖皮質(zhì)激素誘發(fā)骨丟失的可能機(jī)制為［8－9］:①激素可直接抑制成骨細(xì)胞的產(chǎn)生，加速成骨細(xì)胞的凋亡，同時(shí)可抑制胰島素樣生長(zhǎng)因子在成骨細(xì)胞的表達(dá)，降低骨的轉(zhuǎn)換率。②繼發(fā)性甲狀旁腺素分泌增加，激活破骨細(xì)胞，促進(jìn)骨吸收，導(dǎo)致骨量減少。③抑制胃腸道對(duì)鈣的吸收，增加鈣磷的排泄。④可引起睪酮缺乏，抑制十二指腸跨膜鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)載體活性，減少鈣離子結(jié)合蛋白的合成，導(dǎo)致腸道鈣吸收障礙，繼而抑制骨形成，促進(jìn)骨吸收。⑤抑制雌激素分泌，降低鈣磷在骨質(zhì)的沉著。⑥引起脂質(zhì)代謝異常，造成骨髓微脂肪栓形成，骨髓微循環(huán)壓力增高，骨缺血壞死。

由Tab 3的結(jié)果可見，潑尼松使脛骨中段骨組織總面積、皮質(zhì)骨面積均減少。由Fig 3的結(jié)果可見，潑尼松使皮質(zhì)骨的骨外膜的熒光減少。提示潑尼松抑制皮質(zhì)骨的骨外膜的骨形成，導(dǎo)致骨代謝的負(fù)平衡，皮質(zhì)骨量減少，脛骨中段變小。文獻(xiàn)報(bào)道［10］，糖皮質(zhì)激素對(duì)大鼠皮質(zhì)骨的影響主要是使骨外膜面的骨形成減少，并使骨內(nèi)膜面的骨吸收增加，從而導(dǎo)致皮質(zhì)骨變薄，骨髓腔增大。但本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示潑尼松對(duì)骨髓腔面積、骨內(nèi)膜的骨形成無影響，提示潑尼松對(duì)皮質(zhì)骨的骨內(nèi)膜影響不大，具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

由結(jié)果可見，碳酸鈣維D使?jié)娔崴纱笫笱邓少|(zhì)骨的骨量、骨小梁厚度、標(biāo)記周長(zhǎng)百分?jǐn)?shù)、骨礦化沉積率、骨形成率均增加，而使骨吸收參數(shù)降低，提示碳酸鈣加維生素D可預(yù)防糖皮質(zhì)激素誘發(fā)的松質(zhì)骨的骨丟失。碳酸鈣加維生素D預(yù)防骨丟失的機(jī)制為［11］:①碳酸鈣補(bǔ)充骨礦物質(zhì)，促進(jìn)骨礦化，利于骨形成;②維生素D3能增加小腸吸收飲食中鈣和磷，維持鈣磷平衡。在骨重建過程中，維生素D3可增加成骨細(xì)胞活性。③維生素D3合并小劑量鈣，能增加小腸對(duì)鈣的吸收，補(bǔ)充礦物質(zhì)，預(yù)防骨量丟失和減少骨折的發(fā)生。

由結(jié)果可見，小檗堿 15、30、60 mg·kg－1·d－1均使?jié)娔崴纱笫笱邓少|(zhì)骨的骨量、骨小梁厚度、標(biāo)記周長(zhǎng)百分?jǐn)?shù)、骨礦化沉積率、骨形成率均增加，而使骨吸收參數(shù)降低，提示小檗堿可預(yù)防GC誘發(fā)的腰椎松質(zhì)骨的骨丟失，主要是通過促進(jìn)骨形成，抑制骨吸收而實(shí)現(xiàn)的。小檗堿為中草藥黃連、黃柏中的主要活性成分，文獻(xiàn)報(bào)道［12］，小檗堿可通過抑制骨吸收預(yù)防去卵巢大鼠的脛骨上段松質(zhì)骨的丟失。黃柏小檗堿可增加去卵巢大鼠股骨干骺端的骨密度，其機(jī)制可能是抑制骨吸收、促進(jìn)骨形成，促進(jìn)雌二醇和降鈣素合成［13］。小檗堿可促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，增強(qiáng)骨鈣化［14］。小檗堿通過p38 MAPK激活 Runx2而促進(jìn)成骨細(xì)胞分化［15］。小檗堿抑制抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP)陽性多核破骨細(xì)胞的形成和TRAP活性，減少破骨性骨吸收陷窩的面積，提示小檗堿通過抑制破骨細(xì)胞的形成、分化和骨吸收功能減少骨質(zhì)的丟失［16］。小檗堿還可能通過上調(diào)肝臟Insig-2基因表達(dá)，抑制肝臟中膽固醇的合成代謝，發(fā)揮調(diào)節(jié)血脂作用［17］，從而改善糖皮質(zhì)激素所致血脂代謝異常［18］，預(yù)防糖皮質(zhì)激素誘發(fā)的骨丟失和骨壞死。

由Tab 2的結(jié)果可見，小檗堿30 mg·kg－1·d－1中劑量組%L.Pm、BFR/TV、BFR/BV、BFR/BS雖然較正常對(duì)照組增加明顯，但與15 mg·kg－1·d－1低劑量組和 60 mg·kg－1·d－1高劑量組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示小檗堿3個(gè)劑量的作用效果相似，在15 ～60 mg·kg－1·d－1劑量范圍內(nèi)沒有劑量相關(guān)性。小檗堿的劑量相關(guān)性還有待于進(jìn)一步的探索。

由結(jié)果可見，碳酸鈣維 D和小檗堿15、30、60 mg·kg－1·d－1對(duì)潑尼松大鼠脛骨中段皮質(zhì)骨各項(xiàng)參數(shù)均無影響，提示碳酸鈣維D和小檗堿不能預(yù)防糖皮質(zhì)激素誘發(fā)的大鼠皮質(zhì)骨的骨丟失?？赡苁怯捎谄べ|(zhì)骨對(duì)藥物反應(yīng)程度不如松質(zhì)骨敏感，抗骨質(zhì)疏松藥物如氟化物、雙膦酸鹽類以及PTH對(duì)皮質(zhì)骨的效果也均不明顯［19］。

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