甲醛對PC12細(xì)胞內(nèi)源性H2S生成的影響

尹蔚蘭，何劍琴，方恒榮，楊絲絲，胡 弼，唐小卿

(南華大學(xué)生理學(xué)教研室，湖南衡陽 421001)

阿爾采末病(Alzheimer’s disease，AD)是一種神經(jīng)退行性疾病。AD 的特征性病理改變是大腦皮層及皮層下結(jié)構(gòu)細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)元纖維纏結(jié)及細(xì)胞外大量老年斑形成及神經(jīng)元缺失。有研究認(rèn)為老年斑的核心成分 β-淀粉樣多肽(β-amyloid peptide，Aβ)引起的氧化應(yīng)激在AD的發(fā)生發(fā)展中處于中心地位［1］，因此抗氧化已經(jīng)成為目前最為重要的AD防治策略。近年來，一個新的神經(jīng)退行性病變機(jī)制——“醛負(fù)載(aldehyde load)”的概念引起了人們的關(guān)注［2］?；钚匀┰谘趸瘧?yīng)激過程中產(chǎn)生，相當(dāng)多的實驗證據(jù)顯示真正導(dǎo)致可觀察到的細(xì)胞損傷的因素，可能不是氧化應(yīng)激，而是氧化應(yīng)激后生成的活性醛［3］?；钚匀┳鳛檠趸瘧?yīng)激的介質(zhì)，被稱為氧化應(yīng)激的“第二細(xì)胞毒信使(second cytotoxic messenger)”［4］。硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)被 Abe等［5］于1996年首次證實是一種新型的內(nèi)源性神經(jīng)調(diào)質(zhì)(endogenous neuromodulator)，是繼一氧化氮和一氧化碳之后的第3種氣體信號分子。Eto等［6］指出AD患者腦內(nèi)H2S水平明顯降低。最近我們研究發(fā)現(xiàn)H2S可對抗Aβ的神經(jīng)損傷作用［7］。目前，H2S能否對抗醛類物質(zhì)對神經(jīng)細(xì)胞的損傷作用，抑或醛類物質(zhì)能否對抗內(nèi)源性硫化氫的生成，尚未見實驗報道。甲醛是醛類物質(zhì)的一種，本實驗以甲醛損傷來源于大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤的PC12細(xì)胞建立甲醛神經(jīng)毒性的細(xì)胞模型，觀察甲醛對PC12細(xì)胞H2S合成酶的表達(dá)和活性以及內(nèi)源性H2S生成的影響，以闡明甲醛神經(jīng)毒性的機(jī)制，為進(jìn)一步探討H2S的抗甲醛神經(jīng)毒性作用提供新穎的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞和材料PC12細(xì)胞是來源于大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤的細(xì)胞株，源于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，由中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室饋贈。硫氫化鈉(NaHS)、甲醛均購自Sigma公司。RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(兩步法抽提)購自Promega公司;TRIzol、CBS引物、GAPDH引物、PCR擴(kuò)增試劑盒等購自上海生物工程公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)PC12細(xì)胞被置入含15%胎牛血清的 RPMI 1640 培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2、95%O2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。

1.3RT-PCR法檢測CBS mRNATRIzol法提取PC12細(xì)胞總 RNA，用 MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，PCR擴(kuò)增CSB及GAPDH。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結(jié)果并攝片，用Image J 1137V軟件進(jìn)行灰度掃描，以目的基因與GAPDH灰度比值進(jìn)行基因表達(dá)水平的半定量分析。

Gene Primer sequence Length/bp CBS 5'-ATGCTGCAGAAAGGCTTCAT-3' 557 5'-GTGGAAACCAGTCGGTGTCT-3'GAPDH 5'-TGTGATGGTGGGTATGGGTCAG-3' 240 5'-TTTAATGTCACGCACGATTTCC-3'

1.4CBS活性的測定按 Abe等［5］的方法測定CBS的活性，即將裂解后的細(xì)胞勻漿用BCA蛋白定量后加入預(yù)先配制好的反應(yīng)體系［100 mmol·L-1磷酸緩沖液(pH 7.4)、10 mmol·L-1左旋半胱氨酸、2 mmol·L-1磷酸吡哆醛］中。移至反應(yīng)瓶，吸取1%醋酸鋅0.5 ml吸收液加入中間室，另剪裁適當(dāng)大小的濾紙放入中間室，增加吸收面積，然后將反應(yīng)體系放至37℃水浴搖床反應(yīng)90 min后，加入0.5 ml 50%三氯醋酸終止反應(yīng)。隨后在37℃水浴反應(yīng)60 min，使反應(yīng)體系中釋放的H2S被完全吸收。反應(yīng)瓶中間室中的液體按H2S含量的測定方法進(jìn)行。按照BCA蛋白定量的結(jié)果，將測得的H2S含量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，結(jié)果以mmol·min-1·g-1Pro表示。

1.5H2S含量的測定［3］細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，取310 μl細(xì)胞培養(yǎng)液，加入2%醋酸鋅30 μl、20%三氯醋酸 60 μl，然后再加入 20 mmol·L-1二甲基對苯二胺硫酸鹽 40 μl和 30 mmol·L-1三氯化鐵 40 μl，迅速混合均勻后，37℃靜置10 min，670 nm讀取吸光度(A)值。通過NaHS標(biāo)準(zhǔn)曲線計算H2S的轉(zhuǎn)化率。貼壁細(xì)胞經(jīng)裂解后用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行定量，根據(jù)蛋白濃度對檢測的H2S含量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，結(jié)果以 mmol·L-1Pro表示。

1.6MTT法檢測細(xì)胞增殖狀況取對數(shù)生長期細(xì)胞，以0.5 ×107·L-1接種于 96 孔培養(yǎng)板，180 μl/孔。在37℃ 5%CO2條件下培養(yǎng)過夜后，按分組要求給予不同處理因素，每組設(shè)8個平行孔培養(yǎng)24 h后，每孔加 5 g·L-1MTT 20 μl，再培養(yǎng) 4 h，傾去培養(yǎng)液，加DMSO 100 μl/孔，待甲臜完全溶解后，用酶聯(lián)免疫儀在波長570 nm處讀取吸光度(OD)。按下列公式計算細(xì)胞存活率(viability)，細(xì)胞存活率/%=實驗孔OD均值/對照組OD均值×100%計算。整個實驗重復(fù)3次。

1.7統(tǒng)計學(xué)處理數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用One-way ANOVA及LSD-t檢驗。

2 結(jié)果

Fig 1 Effect of formaldehyde on CBS mRNA expression in PC12 cells(±s，n=3)

2.1甲醛對PC12細(xì)胞CBS mRNA表達(dá)的影響用RT-PCR檢測PC12細(xì)胞CBS mRNA的表達(dá)。結(jié)果如Fig 1顯示，應(yīng)用不同濃度(50、100、200 μmol·L-1)的甲醛處理PC12細(xì)胞24h后，與正常對照組相比，CBS mRNA的表達(dá)明顯降低，100、200 μmol·L-1甲醛損傷組與對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義。表明甲醛能明顯地抑制PC12細(xì)胞CBS mRNA的表達(dá)。

2.2甲醛對PC12細(xì)胞CBS活性的影響采用亞甲基藍(lán)分光光度計法檢測不同濃度甲醛處理PC12細(xì)胞24 h后，CBS活性的變化，結(jié)果如Fig 2顯示，100 μmol·L-1和 200 μmol·L-1甲醛作用 PC12 細(xì)胞24 h后，CBS的活性由(0.56 ±0.04)mmol·min-1·g-1Pro 分別下降為(0.4 ± 0.05)mmol·min-1·g-1Pro(P＜0.05)和(0.25 ±0.05)mmol·min-1·g-1Pro(P＜0.01)，表明甲醛能抑制 PC12細(xì)胞CBS的活性。

Fig 2 Effect of formaldehyde on CBS activity in PC12 cells(±s，n=3)

2.3甲醛對PC12細(xì)胞H2S生成的影響Fig 3顯示，PC12 細(xì)胞能生成內(nèi)源性 H2S。100 μmol·L-1和200 μmol·L-1甲醛作用PC12細(xì)胞24 h后，細(xì)胞培養(yǎng)基中 H2S的含量分別由對照組的(489.3±34.6)mmol·g-1Pro 下降到(395.7 ±20.6)mmol·g-1Pro(P＜0.01)和(290 ±29.8)mmol·g-1Pro(P＜0.01)。表明甲醛能抑制PC12細(xì)胞H2S的生成。

2.4甲醛對PC12細(xì)胞存活率的影響Fig 4顯示，100、200 或400 μmol·L-1甲醛作用 PC12 細(xì)胞24 h可使細(xì)胞存活率分別降低為(93.4±11)%、(57.8 ±6.3)%或(40.1 ±5.1)%，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。并且，隨著甲醛濃度的升高，PC12細(xì)胞存活率逐漸降低，各濃度組之間差異有顯著性(P＜0.01)，表明甲醛可濃度依賴性地抑制PC12細(xì)胞的生存。

Fig 3 Effect of formaldehyde on the production of endogenous H2S in PC12 cells(±s，n=3).

Fig 4 Effect of formaldehyde on PC12 cells survival(±s，n=3).

3 討論

PC12細(xì)胞來源于大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤，其形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能與多巴胺能神經(jīng)元相似，因此，常被用來建立研究神經(jīng)元的細(xì)胞模型。本實驗室已應(yīng)用淀粉樣 β 多肽(amyloid β-peptide，Aβ)損傷 PC12細(xì)胞以模擬AD［7］。體內(nèi)含硫氨基酸(如半胱氨酸、甲硫氨酸)在胱硫醚-β-合酶(cystathionine-beta-synthase，CBS)和胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine-gamma-lyase，CSE)作用下可生成內(nèi)源性 H2S［8］。CSE主要存在于血管和心臟，而CBS則主要存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)［9］，我們以往的研究結(jié)果表明PC12細(xì)胞僅有CBS的表達(dá)，而不表達(dá)CSE［10］。因此，本實驗僅檢測CBS。

研究發(fā)現(xiàn)AD患者腦內(nèi)和腦脊液中活性醛(reactive aldehyde)水平明顯增加［11］。大量的證據(jù)表明內(nèi)源性活性醛參與了 AD的病理生理過程［12］。甲醛是一種重要的醛類物質(zhì)，它的毒理作用人們研究的很多。本實驗觀察到，甲醛在抑制PC12細(xì)胞存活率的同時，能明顯地抑制CBS mRNA表達(dá)，并能降低CBS活性，進(jìn)而減少PC12細(xì)胞內(nèi)源性H2S生成。這可能為深入闡明甲醛的毒理作用提供了全新的實驗資料。

H2S是體內(nèi)第3種氣體信號分子，被公認(rèn)為一種重要的神經(jīng)調(diào)質(zhì)［7］?，F(xiàn)已證實，H2S能保護(hù)神經(jīng)元對抗谷氨酸［13］和 HOCl［14］引起的氧化應(yīng)激損傷作用。本實驗觀察到，甲醛能誘導(dǎo)PC12細(xì)胞存活率的降低。通過上述的結(jié)果，本文推測，由于甲醛抑制了 PC12細(xì)胞 CBS表達(dá)和活性，導(dǎo)致內(nèi)源性H2S生成減少，進(jìn)而削弱了PC12細(xì)胞的抗損傷能力，從而導(dǎo)致PC12細(xì)胞存活率降低。

綜上所述，本文證實甲醛可通過抑制PC12細(xì)胞CBSmRNA表達(dá)和CBS的活性，減少內(nèi)源性H2S生成，從而抑制PC12細(xì)胞的存活率。本文為深入闡明甲醛的神經(jīng)毒性機(jī)制提供了有意義的實驗依據(jù)。

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