大鼠伏核內(nèi)注射嗎啡及其受體阻斷劑對(duì)其Nogo-A和CGRP mRNA表達(dá)的影響

王 燕，孟 蒂，李 寧

(濰坊醫(yī)學(xué)院應(yīng)用藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)室，山東濰坊 261053)

NAc是腦獎(jiǎng)賞通路的重要核團(tuán)，并在痛覺(jué)調(diào)制過(guò)程中發(fā)揮重要作用。Nogo-A是新發(fā)現(xiàn)的一類抑制受損軸突再生的抑制性蛋白，廣泛分布于中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)［1－2］。Nogo-A存在于與痛覺(jué)調(diào)制有關(guān)的腦區(qū)［3］，提示Nogo-A可能參與了痛覺(jué)調(diào)制過(guò)程，但相關(guān)研究很少。CGRP是1982年發(fā)現(xiàn)的一種生物活性多肽，廣泛分布于中樞、外周神經(jīng)系統(tǒng)及其它外周組織，且在與痛覺(jué)密切相關(guān)的腦區(qū)有表達(dá)，如NAc、中腦導(dǎo)水管灰質(zhì)和杏仁核等部位。近年來(lái)的研究證實(shí):在NAc內(nèi)CGRP與內(nèi)源性阿片系統(tǒng)共同參與了痛覺(jué)的調(diào)制過(guò)程。我們的研究發(fā)現(xiàn)腦內(nèi)Nogo-A也與痛覺(jué)調(diào)制過(guò)程有關(guān)。進(jìn)一步證實(shí)并闡明Nogo-A參與痛覺(jué)調(diào)制過(guò)程及其作用，對(duì)于豐富中樞痛覺(jué)調(diào)制理論具有重要意義。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物健康SD大鼠(♂，280～320 g)，由山東魯抗提供(許可證號(hào):SCXK魯2008 0002)。

1.2主要藥物和試劑UNIQ-10柱式總RNA抽提純化試劑盒、AMV第一鏈cDNA合成試劑盒、PCR(Taq)擴(kuò)增試劑盒和引物合成均為上海生工生物工程有限公司產(chǎn)品。鹽酸納洛酮(批號(hào):20081108，北京凱因科技股份有限公司);硫酸嗎啡注射液 (批號(hào):20070417，青海制藥廠有限公司)。

1.3行為藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)

1.3.1 術(shù)前準(zhǔn)備(訓(xùn)練大鼠)術(shù)前對(duì)大鼠進(jìn)行熱板測(cè)試訓(xùn)練，以使動(dòng)物對(duì)熱刺激的反應(yīng)較為平穩(wěn)。訓(xùn)練持續(xù)進(jìn)行5 d，訓(xùn)練后大鼠后爪縮爪反應(yīng)的潛伏期(hindpaw withdrawal lantecy，HWL)平均在3～5 s。

1.3.2熱板測(cè)試實(shí)驗(yàn)(hot-plate test)方法熱板(YLS-6A型智能熱板儀，山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院設(shè)備站)溫度維持在52℃左右(51.7℃ ～52.3℃)。手握住大鼠身體，將待測(cè)后爪放在熱板上，稍加壓力，使其后爪的掌部緊貼熱板表面。然后踩下腳踏開(kāi)關(guān)，儀器開(kāi)始計(jì)時(shí)，當(dāng)大鼠后爪回縮時(shí)，儀器計(jì)時(shí)停止，記錄的時(shí)間即為大鼠的HWL。

1.3.3動(dòng)物分組將熱板測(cè)試訓(xùn)練后的32只大鼠隨機(jī)分為4組，其中，空白對(duì)照組8只，實(shí)驗(yàn)時(shí)向NAc內(nèi)注射等量生理鹽水1 μl;福爾馬林致炎24只，先分別足掌皮下注射10 g·L－1的福爾馬林0.1 ml;致炎成功后再將其等分為3組:痛敏模型對(duì)照組、嗎啡組和納洛酮組，分別向NAc核團(tuán)注射生理鹽水、嗎啡和納洛酮各1 μl。

1.3.4腦內(nèi)埋管手術(shù)用戊巴比妥鈉40 mg·kg－1腹腔注射麻醉大鼠，將大鼠頭部固定在立體定位儀(SN-2，日本NARISHIGE公司)上，剪去頭頂部皮膚及皮下結(jié)締組織，使顱骨充分暴露，在前囟和后囟用墨點(diǎn)做好標(biāo)記。調(diào)整立體定位儀的坐標(biāo)系統(tǒng)，用骨鉆垂直顱骨鉆開(kāi)直徑大約為1 mm的圓形孔，將一直徑為0.8 mm的不銹鋼套管垂直插入右側(cè)NAc上2 mm(B 2.0，L 1.5，H 6.8 mm)，用牙托粉固定。動(dòng)物手術(shù)后需休養(yǎng)2～3 d方能進(jìn)行行為藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)。

1.3.5痛敏模型制作用微量注射器將10 g·L－1福爾馬林0.1 ml注入大鼠一側(cè)后爪掌心皮下，5 min后熱板測(cè)試動(dòng)物HWL時(shí)間(s)。大鼠在注射福爾馬林后立即出現(xiàn)舔咬和抬縮后肢，持續(xù)3～5 min，注射后15～20 min再次出現(xiàn)上述癥狀，說(shuō)明造模成功，隨時(shí)間推移，注射側(cè)后肢出現(xiàn)紅腫，活動(dòng)輕度受限，說(shuō)明出現(xiàn)了炎性痛及痛過(guò)敏，在3 d后進(jìn)行核團(tuán)注射。

1.3.6核團(tuán)注射實(shí)驗(yàn)方法給藥前先熱板測(cè)試大鼠HWL，然后用一根外徑0.4 mm的注射管插入埋植好的套管，注射管超出套管末端1 mm，向大鼠NAc注入藥物，注射持續(xù)時(shí)間約為1 min。在給藥后5、10、20、30、45、60 min 分別熱板測(cè)試大鼠的 HWL;實(shí)驗(yàn)結(jié)束做注射部位鑒定，見(jiàn)Fig 1。

Fig 1 Illustration of the location of the needle tips in the NAc

1.4取NAc區(qū)域腦組織核團(tuán)注射后60 min，將大鼠用戊巴比妥鈉40 mg·kg－1麻醉，并固定于腦立體定位儀上。為準(zhǔn)確取出NAc區(qū)域腦組織，用一段直徑0.8 mm的不銹鋼針在大鼠腦NAc前 (B 3.0，H 6 mm)、后 (B 0.48，H 6.8 mm)各做一標(biāo)記，取出腦組織，沿NAc前、后做的標(biāo)記做冠狀切片，用內(nèi)徑1.5 mm的玻璃管，以標(biāo)記為中心鉆孔，取出NAc區(qū)域腦組織置于液氮中備用。

1.5 RT-PCR檢測(cè)Nogo-A mRNA和CGRP mRNA的表達(dá)RT-PCR按照上海生工生物工程有限公司試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。大鼠Nogo-A、CGRP及β-actin的引物序列及片段長(zhǎng)度(見(jiàn)Tab 1)，引物合成:查基因庫(kù)，進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，由上海生工生物工程有限公司合成。

RT-PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)熱變性5 min，94℃變性45 s，58℃退火45 s，72℃延伸1 min，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，末次循環(huán)后72℃延伸10 min。每個(gè)樣品均設(shè)4個(gè)復(fù)孔，以保證實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性。同時(shí)做了陰性對(duì)照和“no-RT”對(duì)照。陰性對(duì)照用無(wú)RNA酶的水代替RNA模板，“no-RT”對(duì)照用無(wú)RNA酶的水代替逆轉(zhuǎn)錄酶。記錄每個(gè)樣品CT平均值，并用βactin做內(nèi)參來(lái)標(biāo)準(zhǔn)化反應(yīng)樣品的RNA的量。

1.6瓊脂糖凝膠電泳分別取5 μl PCR反應(yīng)產(chǎn)物，加上樣緩沖液1 μl，以10×TAE為電泳緩沖液，EB染色鑒定，在20 g·L－1瓊脂糖凝膠中電泳約1 h(電壓60 V)，將瓊脂糖凝膠置于數(shù)碼成像分析系統(tǒng)(gene genius bio-imaging system，USA)下觀察拍片，并觀察有無(wú)非特異性擴(kuò)增。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，測(cè)得數(shù)據(jù)用±s表示。各組之間用單因素方差分析(ANOVA)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠后爪縮爪潛伏期的變化與空白對(duì)照組相比，福爾馬林致炎模型組可以明顯縮短大鼠后爪對(duì)熱刺激的HWL(P＜0.05)，該效應(yīng)在給藥后5～15 min最為明顯，持續(xù)大約60 min;與福爾馬林致炎的痛敏模型對(duì)照組相比，嗎啡組大鼠的HWL(P＜0.01)明顯延長(zhǎng)，而納洛酮組大鼠后爪對(duì)熱刺激的HWL無(wú)變化(P＞0.05)。

2.2 Nogo-A mRNA和CGRP mRNA的表達(dá)各組大鼠NAc內(nèi)Nogo-A mRNA與CGRP mRNA均有表達(dá)。RT-PCR結(jié)果顯示，陰性對(duì)照和“no-RT”對(duì)照未擴(kuò)增出目標(biāo)產(chǎn)物，而NAc組織中則擴(kuò)增出了Nogo-A mRNA與CGRP mRNA的基因片段，表明總反應(yīng)體系無(wú)污染，大鼠NAc內(nèi)有Nogo-A mRNA與CGRP mRNA的表達(dá)。與空白對(duì)照組比較，痛敏模型對(duì)照組大鼠NAc內(nèi)Nogo-A mRNA表達(dá)量降低(P＜0.05)，CGRP mRNA表達(dá)量增高(P＜0.01);與痛敏模型對(duì)照組比較，嗎啡組Nogo-A mRNA表達(dá)量增高(P＜0.01)，CGRP mRNA的表達(dá)量降低(P＜0.05)，而納洛酮組Nogo-A mRNA表達(dá)量降低(P＜0.05)，CGRP mRNA 的表達(dá)量增高(P＜0.05)，見(jiàn)Tab 2。

Tab 1 Primer sequences for RT-PCR

Tab 2 Analysis of RT-PCR products in NAc(±s，n=8)

Tab 2 Analysis of RT-PCR products in NAc(±s，n=8)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs blank control group;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs hyperalgesia model control group

CT β-actin/CT CGRP Blank control 13.813 ±0.114 13.605 ±0.106 13.Group CT β-actin CT Nogo-A CT CGRP CT β-actin/CT Nogo-A 751 ±0.087 1.015 ±0.009 1.005 ±0.005 Hyperalgesia model control 13.851 ±0.021 13.774 ±0.134 13.600 ±0.108 1.005 ±0.009* 1.019 ±0.009＊＊Morphine 13.852 ±0.061 13.574 ±0.100 13.834 ±0.240 1.021 ±0.006## 1.002 ±0.018#Naloxone 13.837 ±0.085 13.920 ±0.141 13.837 ±0.051 0.994 ±0.009# 1.036 ±0.020#

瓊脂糖凝膠電泳證明，在采用3對(duì)引物進(jìn)行的RT-PCR實(shí)驗(yàn)過(guò)程中均有特異性DNA擴(kuò)增產(chǎn)物，陰性對(duì)照和“no-RT”對(duì)照未出現(xiàn)特異性DNA擴(kuò)增產(chǎn)物(Fig 2)。

Fig 2 Agarose gel electrophoresis result of RT-PCR products in NAc

3 討論

NAc是中腦-邊緣多巴胺系統(tǒng)環(huán)路的重要核團(tuán)，NAc內(nèi)有豐富的阿片肽能神經(jīng)纖維和各種類型的阿片受體，刺激NAc能引起痛閾的升高。NAc聯(lián)系纖維分為內(nèi)、外側(cè)兩部分，其內(nèi)側(cè)部主要走向終紋、丘腦、大腦水管周圍和中腦腹側(cè);外側(cè)部趨向嗅結(jié)節(jié)、前穿質(zhì)等腦底結(jié)構(gòu)［4］。目前研究表明NAc與鎮(zhèn)痛、藥物成癮、行為調(diào)控、學(xué)習(xí)記憶、心血管活動(dòng)等功能的調(diào)節(jié)有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)所采用的福爾馬林痛敏模型是傷害作用的標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物模型之一，其疼痛過(guò)程表現(xiàn)為雙相傷害性反應(yīng):第1時(shí)相在注射后立即發(fā)生，表現(xiàn)為舔咬和抬縮后肢，持續(xù)3～5 min;第2時(shí)相出現(xiàn)在注射后15～20 min，但上述癥狀逐漸減弱。雖然動(dòng)物自發(fā)性疼痛行為僅持續(xù)60～90 min，但注射側(cè)后肢以及對(duì)側(cè)后肢仍對(duì)機(jī)械和溫度傷害性刺激處于過(guò)度敏感狀態(tài)，可持續(xù)4周，在福爾馬林注射后3 d炎癥最明顯［5］。

CGRP是一種神經(jīng)遞質(zhì)，有強(qiáng)心、擴(kuò)張血管和促進(jìn)血管新生［6］的作用，是目前發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)大的內(nèi)源性舒血管物質(zhì)。近年來(lái)CGRP在痛覺(jué)調(diào)制方面研究比較多，現(xiàn)已證實(shí)CGPP參與了杏仁體、大腦水管周圍灰質(zhì)的痛覺(jué)調(diào)制并發(fā)揮重要作用［7－8］，CGRP 及其受體在炎癥反應(yīng)及NAc痛覺(jué)調(diào)制過(guò)程中也發(fā)揮著重要作用［9－10］，它可以通過(guò)多種途徑促進(jìn)傷害性信息的傳遞與痛覺(jué)過(guò)敏的產(chǎn)生。此外，CGRP的表達(dá)與內(nèi)源性阿片系統(tǒng)也存在一定的聯(lián)系［11－12］。Nogo蛋白是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一種中樞神經(jīng)再生抑制因子，有3種同源異構(gòu)體:Nogo-A、Nogo-B和Nogo-C。Nogo蛋白羧基端與神經(jīng)內(nèi)分泌特異性蛋白和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)漿膜蛋白家族高度同源，都具有一個(gè)雙賴氨酸的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)保守基序，可能是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的保守信號(hào)［13］。目前關(guān)于Nogo-A功能研究最多的是其在神經(jīng)再生方面的作用。Nogo-A樣免疫反應(yīng)產(chǎn)物廣泛分布于大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元及其纖維，在NAc有中等強(qiáng)度的Nogo-A陽(yáng)性神經(jīng)元和纖維［3］。Nogo-B普遍存在于各種組織，調(diào)節(jié)血管動(dòng)態(tài)平衡和重構(gòu)，也可能參與了誘導(dǎo)凋亡［14－15］;Nogo-C 主要在肌肉表達(dá)［16］，其具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)用RT-PCR方法證實(shí)大鼠致炎產(chǎn)生痛敏后，NAc內(nèi)Nogo-A和CGRP mRNA的表達(dá)量發(fā)生了相互變化，提示:它們可能在該區(qū)域都參與了痛覺(jué)調(diào)制過(guò)程，且二者呈反向調(diào)節(jié);在痛敏模型大鼠NAc內(nèi)注射嗎啡，其Nogo-A mRNA的表達(dá)與痛敏模型對(duì)照組比較明顯增加，同時(shí)這種作用可被阿片受體拮抗劑納洛酮所取消。結(jié)果提示在大鼠NAc內(nèi)Nogo-A、CGRP及內(nèi)源性阿片系統(tǒng)在痛覺(jué)調(diào)制方面存在著相互影響。然而，痛覺(jué)調(diào)制是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，其具體機(jī)制及相關(guān)遞質(zhì)的表達(dá)研究目前尚未明了，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步豐富了痛覺(jué)調(diào)制理論，還可能為尋找治療疼痛的新途徑、新方法和新的藥物靶點(diǎn)提供新的研究方向。

［1］Woolf C J，Bloechlinger S.It takes more than two to Nogo［J］.Science，2002，297(5584):1132 －4.

［2］Chen M S，Huber A B，van der Haar M E，et al.Nogo-A is amyelin-associated neurite outgrowth inhibitor and an antigen formonoclonal antibody IN-1［J］.Nature，2000，403(6768):434 －9.

［3］程希平，劉慧玲，宋朝君，等.Nogo-A在成年大鼠腦內(nèi)神經(jīng)元的分布［J］.解剖學(xué)報(bào)，2005，36(5):465－70.

［3］Cheng X P，Liu H L，Song C J，et al.Immunohistochemical localization of Nogo-A in the neurons of the brain of adult rat［J］.Acta Anatom Sin，2005，36(5):465 －70.

［4］何維為，王鐵民，魏孝琴.人腦伏核的應(yīng)用解剖學(xué)研究［J］.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，36(1):1 －4.

［4］He W W，Wang T M，Wei X Q.Applied anatomy of nucleus accumbens in human brain［J］.J China Med Univ，2007，36(1):1－4.

［5］Fu K Y，Light A R，Maixner W.Long-lasting inflammation and long-term hyperalgesia after subcutaneous formalin injection into the rat hindpaw［J］.J Pain，2001，2(1):2 －11.

［6］孫保亮，申發(fā)平，曹明志，等.CGRP經(jīng)鼻用藥促進(jìn)蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血供和VEGF表達(dá)［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2009，25(12):1571－4.

［6］Sun B L，Shen F P，Cao M Z，et al.Promotion of cerebral blood supply and expression of vascular endothelial growth factor by intranasal delivery of calcitonin gene-related peptide after subarachnoid hemorrhage［J］.Chin Pharmacol Bull，2009，25(12):1571－4.

［7］Li N，Liang J，F(xiàn)ang C Y.Involvement of CGRP and CGRPl receptor in nociception in the basolateral nucleus of amygdala of rats［J］.Neurosci Lett，2008，443:184 －7.

［8］Yu L C，Hou J F，F(xiàn)u F H，et al.Roles of calcitonin gene-related peptide and its receptors in pain-related behavioral responses in the central nervous system［J］.Neurosci Biobehav Rev，2009，33(8):1185－91.

［9］房春燕，李 寧，史立宏，等.神經(jīng)性痛和炎性痛大鼠伏核內(nèi)CGRP mRNA表達(dá)的變化［J］.神經(jīng)解剖學(xué)雜志，2007，23(2):155－8.

［9］Fang C Y，Li N，Shi L H，et al.Changes of CGRP mRNA expression in the nucleus accumbens of rats with neuropathic and inflammatory pain［J］.Chin J Neuroanat，2007，23(2):155 －8.

［10］Li N，F(xiàn)ang C Y，Wang Z Z，et al.Expression of calcitonin gene-related peptide type 1 receptor mRNA and their activity-modifying proteins in the rat nucleus accumbens［J］.Neurosci Lett，2004，362(2):146－9.

［11］陸 姚，范禮斌，張 野，等.中樞嗎啡預(yù)處理對(duì)心臟缺血后大鼠海馬CaM、血漿CGRP以及下丘腦室旁核和心肌P物質(zhì)表達(dá)的影響［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2009，25(8):1072－7.

［11］Lu Y，F(xiàn)an L B，Zhang Y，et al.Effects of intracerebroventricular morphine preconditioning on expression of calmodulin in hippocampus，calcitonin gene related peptide in plasma，substance P in hypothalam ic paraventricular nucleus andmyocardium in myocardial postischem ia injury rats［J］.Chin Pharmacol Bull，2009，25(8):1072－7.

［12］陸 姚，張 野，王 苑，等.CGRP、KATP通道和脊神經(jīng)在鞘內(nèi)注射嗎啡預(yù)處理減輕大鼠心肌缺血后損傷中的作用［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2010，26(7):886 －90.

［12］Lu Y，Zhang Y，Wang Y，et al.Role of calcitonin gene related peptide，ATP sensitive potassium channel and spinal nerve in the protective effects of intrathecalmorphine preconditioning against myocardial postischemia injury in rats［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(7):886 －90.

［13］Diekmann H，Klinger M，Oertle T，et a1.Analysis of the reticubn gene family demonstrates the absence of the neurite growth inhibitor Nogo-A in fish［J］.Mol Biol Evol，2005，22(8):1635 － 48.

［14］Acewedo L，Yu J，Erdjument-Bromage H，et al.A new role for Nogo as a regulator of vascular remodeling［J］.Nat Med，2004，10:382－8.

［15］Tambe Y，Isono T，Haraguchi S，et al.A novel apoptotic pathway induced by the drs tumor suppressor gene［J］.Oncogene，2004，23(17):2977－87.

［16］Kim J E，Bonilla I E，Qiu D，et al.Nogo-C is sufficient to delay nerve regeneration［J］.Mol Cell Neurosci，2003，23(3):451 －9.