桑葉提取物在大鼠體內(nèi)的代謝產(chǎn)物含量測定及其藥動學(xué)研究

蔣立娣，宣貴達，趙 嵐，朱炎斐，樓雪芳

(浙江大學(xué)城市學(xué)院醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310015)

桑葉作為傳統(tǒng)的中藥材之一，具有藥性平和、無毒副作用等特點，已經(jīng)被國家衛(wèi)生部正式歸入“藥食同源”之列，引起眾多研究者的關(guān)注。黃酮類化合物是桑葉中主要的藥理活性成分之一，它們含有多個羥基，主要以與葡萄糖、鼠李糖等結(jié)合成為糖苷的形式存在。研究表明，絕大多數(shù)黃酮苷類化合物口服后，首先在腸道微生物或/及小腸上皮細胞水解酶作用下，轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的黃酮苷元而被吸收，因此，口服黃酮苷類化合物的效應(yīng)成分多為其苷元［1-3］。綜觀文獻，許多對桑葉黃酮類化合物的研究往往集中在含量測定和藥理學(xué)研究方面，如抗炎、抗氧化、降血糖、降血脂等［4-6］，而對其在生物體內(nèi)的含量測定和吸收情況的研究未見文獻報道，相關(guān)的研究是銀杏類藥物中黃酮的體內(nèi)含量測定和生物利用度比較［7-8］。因此，為了探究桑葉提取物效應(yīng)成分在體內(nèi)的吸收和代謝情況，為桑葉類藥物的臨床藥代動力學(xué)研究提供一定的參考，建立大鼠血漿中槲皮素、山萘酚和異鼠李素的測定方法很有積極意義。在本研究中，我們建立了同時測定大鼠血漿中槲皮素、山萘酚和異鼠李素的高效液相色譜法，并以建立的方法考察了大鼠口服桑葉提取物后各主要代謝產(chǎn)物濃度隨時間的變化，以DAS藥動學(xué)軟件計算了統(tǒng)計矩參數(shù)。

1 材料和方法

1.1 儀器與試藥 Agilent1100高效液相色譜儀，DAD檢測器，四元泵，Agilent1100 Chemstation(Agilent公司)。

槲皮素和山萘酚對照品(中國藥品生物制品檢定所)，異鼠李素和木犀草素對照品(南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，HPLC級，含量≥98%);桑葉提取物(浙江大學(xué)藥學(xué)院藥物研究所提供);甲醇為國產(chǎn)色譜純，其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 實驗動物 SD大鼠，5只，雄性，180～230 g，清潔級，浙江省實驗動物中心提供。

1.3 色譜條件 色譜柱:Agilent Zorbax SB-C18色譜柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm);流動相:甲醇∶0.2% 磷酸 =50∶50(v/v)，流速:1.0 ml/min;檢測波長:380 nm;柱溫:37℃;進樣量:75 μl;內(nèi)標法定量。

1.4 大鼠血樣的采集 大鼠于實驗前15 h禁食(自由飲水)，后尾靜脈采血0.25 ml作為空白血漿，接著灌胃給藥 FME(110 mg/kg)的0.5%CMC-Na混懸液。在分別給藥后的0.0833、0.333、0.667、1.00、1.50、2.00、3.00、4.00、6.00、8.00、12.0、24.0、48.0、72.0、96.0、120 h，從尾靜脈取血約0.25 ml，置于肝素化的離心管中，10000 r/min離心5 min，分離血漿，－20℃冰箱中保存，備用。

1.5 血漿樣品預(yù)處理 精密移取血漿0.1 ml置10 ml離心管中，精密加入9.996 μg/ml的內(nèi)標物質(zhì)木犀草素9.0 μl，漩渦混勻1 min，然后漩渦并緩慢加入濃度為3 mol/L HCl 0.2 ml，90℃水浴中水解1 h，冰浴冷卻，冷卻后精密加入乙醚-丙酮(14∶1)混合液3.0 ml，漩渦提取5 min，4000 r/min離心10 min，完全移取上清液揮干，殘渣加入流動相150 μl，漩渦溶解1 min，13000 r/min 離心 10 min，取上清液 75 μl，HPLC進樣分析。

2 結(jié)果

2.1 方法選擇性 通過調(diào)節(jié)流動相比例，當甲醇∶0.2%的磷酸為50∶50(v/v)時槲皮素、木犀草素、山萘酚和異鼠李素均達到基線分離?？瞻籽獫{、空白血漿+對照品以及給藥后血漿樣品的HPLC圖譜見圖1。由圖可知，空白血漿在槲皮素、木犀草素、山萘酚和異鼠李素保留時間處均無干擾峰，說明血漿內(nèi)源性物質(zhì)不影響本實驗的測定，即本方法具有較好的選擇性。

圖1 大鼠血漿HPLC圖譜Fig.1 Representative HPLC chromatograms of rat plasma

2.2 標準曲線與定量下限 精密移取對照品溶液適量于離心管中，以空白血漿配成含槲皮素、山萘酚和異鼠李素的濃度分別在0.0545～8.73 μg/ml、0.0954 ～ 14.7 μg/ml、0.0545 ～8.55 μg/ml間的7個不同濃度的標準含藥血漿質(zhì)控樣品，每一濃度3份，按“1.5”項下操作。以藥物與木犀草素峰面積的比值為縱坐標(Y)，藥物濃度為橫坐標(X)，進行線性回歸，獲得槲皮素、山萘酚和異鼠李素的回歸方程分別為:y1=0.3724x1+0.157(r=0.9979);y2=0.568x2－0.0444(r=0.9993);y3=0.4042x3－0.0179(r=0.9981)。表明槲皮素在0.0545～8.73 μg/ml，山萘酚在 0.0954 ～14.7 μg/ml，異鼠李素在0.0545～8.55 μg/ml范圍內(nèi)線性良好。槲皮素、山萘酚和異鼠李素的定量下限(LOQ)分別為 0.0545、0.0954和 0.0545 μg/ml。

2.3 回收率 精密移取對照品溶液適量于離心管中，以空白血漿配成含槲皮素、山萘酚及異鼠李素的濃度為(0.148，0.260，0.148)、(3.04，5.34，2.85)、(6.53，11.0，6.56)μg/ml的質(zhì)控樣品，每一質(zhì)量濃度制備5份樣品，按“1.5”項下操作。以槲皮素、山萘酚、異鼠李素及內(nèi)標與相同藥物濃度條件下純?nèi)軇悠穼φ諛颖具M樣后得到的峰面積進行比較，計算提取回收率;以槲皮素、山萘酚和異鼠李素與內(nèi)標峰面積的比值代入隨行標準曲線求得各質(zhì)量濃度測定值，與加入量比較計算方法回收率，結(jié)果見表1。

結(jié)果表明，高、中、低3個質(zhì)量濃度下槲皮素和山萘酚的絕對回收率均高于79.4%，但低濃度下異鼠李素的絕對回收率為62.8%，偏低;三者的方法回收率均在94.7% ～107% 。

2.4 方法精密度 精密移取對照品溶液適量于離心管中，以空白血漿配成含槲皮素、山萘酚及異鼠李素的濃度為(0.148，0.260，0.148)、(3.04，5.34，2.85)、(6.53，11.0，6.56)μg/ml的質(zhì)控樣品，每一質(zhì)量濃度制備5份樣品，按“1.5”項下操作，記錄槲皮素、山萘酚及異鼠李素與木犀草素的峰面積比值，代入標準曲線求得各質(zhì)控樣品的濃度值。計算日內(nèi)精密度RSD和5 d內(nèi)的日間精密度RSD，結(jié)果見表2。

表1 槲皮素、山萘酚和異鼠李素的回收率Table 1 Recoveries of extraction and assay for quercetin，kaempferol and isorhamnetin(n=5)

表2 槲皮素、山萘酚和異鼠李素的方法精密度Table 2 Presicion of assay for quercetin，kaempferol and isorhamnetin(n=5)

從表2中可知，槲皮素、山萘酚及異鼠李素的日內(nèi)和日間精密度RSD分別小于9.5%和9.8%，表明該方法準確、精密，重復(fù)性較好。

2.5 樣品穩(wěn)定性 精密移取對照品溶液適量于離心管中，以空白血漿配制高、低濃度的質(zhì)控樣品，其中槲皮素(0.300，6.53)μg/ml、山萘酚(0.525，11.0)μg/ml、異鼠李素(0.300，6.56)μg/ml。每一質(zhì)量濃度3份樣品，按“1.5”項下操作，分別于室溫 0、4、8 h 及 －20℃ 3、7、15 h以及解凍凍融1、2、3次后測定，記錄槲皮素、山萘酚和異鼠李素與木犀草素的峰面積的比值，代入標準曲線求得各質(zhì)控樣品的濃度值，并與同濃度0 h質(zhì)控樣品比較后計算回收率。

結(jié)果表明，樣品在－20℃冷凍15 d后三者含量均在90.4% ～103%內(nèi)，穩(wěn)定性良好。而在室溫條件下，山萘酚穩(wěn)定性良好，8 h后，高低濃度下的回收率分別為75.8%和80.8%;異鼠李素的穩(wěn)定性不及山萘酚，8 h后，高濃度下的回收率僅為60.0%;槲皮素的穩(wěn)定性明顯欠缺，8 h后，高低濃度下的回收率均低于50%，提示樣品不宜在室溫條件下長時間置放。結(jié)果也表明，經(jīng)過2次凍融解凍過程后，待測成分各濃度均在初始濃度的85.5% ～96.7%內(nèi)，但經(jīng)過3次凍融，槲皮素高低濃度下、異鼠李素低濃度下的濃度降低較多，僅為初始濃度的74.6%～77.4%，提示實際測定時樣品最多進行2次凍融。

2.6 大鼠體內(nèi)的藥動學(xué) 大鼠灌胃給藥FME(110 mg/kg)，收集給藥前及給藥后0.0833、0.333、0.667、1.00、1.50、2.00、4.00、6.00、8.00、12.0、24.0、48.0、72.0、96.0、120 h 時間點血漿。通過建立的HPLC方法，測定不同時間點血漿中槲皮素、山萘酚及異鼠李素的總濃度，利用DAS軟件，計算統(tǒng)計矩參數(shù)，結(jié)果見表3和圖2。

表3 大鼠口服桑葉提取物后血漿中槲皮素、山萘酚及異鼠李素的藥動學(xué)參數(shù)Table 3 Pharmacokinetic parameters of quercetin，kaempferol and isorhamnetin in rat plasma after oral administration of FME(n=5)

由圖2可見，大鼠灌胃給藥(110 mg/kg)FME后槲皮素、山萘酚及異鼠李素迅速達到一個峰濃度，6 h左右，山萘酚和異鼠李素第二次達到峰濃度;同時，由表3可知，三者的T1/2z分別為 92.7，67.9 和54.2 h。這提示三者在大鼠體內(nèi)分布非常迅速，而滯留非常久長。

3 討論

考慮到槲皮素、其它的黃酮類或異黃酮在血漿和尿液中多以甲基化/葡糖醛酸化/硫酸化的結(jié)合物形式存在，大鼠血漿中槲皮素、山萘酚及異鼠李素很可能是以游離和結(jié)合兩種形式并存。因此，本研究將給藥后血漿水解再進行測定，使三者的葡萄糖醛酸、硫酸酯以及其他結(jié)合物均能水解成游離的單體，進而測定各代謝產(chǎn)物的總濃度。研究用單因素考察的方法考察了鹽酸濃度、水浴溫度和水解時間對水解結(jié)果的影響，結(jié)果表明，鹽酸濃度為3 mol/L，水浴溫度為90℃，水解時間為60 min時，各代謝產(chǎn)物的提取效率較為理想。

圖2 大鼠口服FME(110 mg/kg)后的平均血漿藥物濃度-時間曲線Fig.2 The plasma concentration-time curve of quercetin，kaempferol and isorham-netin in rats after oral administration of FME(110 mg/kg).Data are expressed as mean±SD(n=5)

在內(nèi)標的選擇中，我們曾采用芹菜素，但芹菜素出峰時間較晚。后考慮到木犀草素結(jié)構(gòu)與被測物相似，根據(jù)文獻［9］，其油水分配系數(shù)(1ogP)為 2.30，介于槲皮素(2.10)和山萘酚(2.50)之間，分析其保留時間可能也在兩者之間，且我們在做桑葉提取物水解槲皮素和山萘酚含量測定［10］時，在本研究流動相條件下，并未檢測出木犀草素。實驗證實，木犀草素的保留時間恰好落在槲皮素和山萘酚之間，槲皮素、山萘酚、異鼠李素和木犀草素的絕對回收率相差接近10%，符合內(nèi)標法測定的要求。

本研究中，藥動學(xué)結(jié)果提示，槲皮素、山萘酚和異鼠李素在大鼠體內(nèi)的分布迅速，而滯留久長。研究同時顯示，山萘酚和異鼠李素出現(xiàn)雙峰現(xiàn)象，這和文獻報道一致，可能是存在肝腸循環(huán)，引起血漿濃度的再次集結(jié)。結(jié)果也提示，大鼠口服的劑量可能偏高，致使各代謝產(chǎn)物的終末相半衰期遠大于文獻報道。同時我們也認為，本研究的藥物為桑葉提取物，組成成分之間的相互作用可能會使吸收、分布、代謝等轉(zhuǎn)運環(huán)節(jié)發(fā)生變化，也有可能其中的其它成分在體內(nèi)的代謝與效應(yīng)成分的代謝一致，致使循環(huán)吸收和消除相半衰期延長。但桑葉是一種無毒副作用的傳統(tǒng)中藥材，血漿中長時間較高的藥物濃度，更有利于其生物利用度的提高和藥效作用。

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