欖香烯對(duì)人肝癌HepG-2細(xì)胞增殖及拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ的影響

龔敏 梁鑫淼 崔曉楠

1.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤科，遼寧 大連 116011；

2.中科院大連化學(xué)物理研究所制藥工程與過程化學(xué)研究中心，遼寧 大連 116023

目前治療原發(fā)性肝癌缺乏有效的治療藥物，療效差，易產(chǎn)生多藥耐藥，并且不良反應(yīng)較大，因而探索高效低毒的抗肝癌藥物歷來是熱點(diǎn)問題［1］。欖香烯(elemene，ELE )是從活血化瘀中藥姜科植物溫莪術(shù)中提取出的抗癌活性單體，臨床應(yīng)用表明，ELE對(duì)多種腫瘤具有抑制作用，表現(xiàn)出高效低毒的中藥特質(zhì)，尤其對(duì)肝癌顯示出良好臨床療效［2］。然而其機(jī)制有待深入研究。DNA 拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ(topoisomerase Ⅰ，TOPOⅠ)是調(diào)節(jié)核酸拓?fù)錁?gòu)型的關(guān)鍵酶，已成為抗癌藥物研究的重要靶點(diǎn)之一［3］。本文探討ELE對(duì)人肝癌HepG-2細(xì)胞增殖及TOPOⅠ表達(dá)及活性的影響，為解析ELE作用機(jī)制及探索有效的肝癌藥物奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

人肝癌細(xì)胞株HepG-2由大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室傳代、保存；ELE購(gòu)自大連金港制藥有限公司(批號(hào)0508031)；羥基喜樹堿(hydroxycam ptothecin，HCPT)購(gòu)自深圳萬東藥業(yè)有限公司；MTT購(gòu)自Biosharp公司；PBR322DNA、TOPOⅠ和RT-PCR試劑盒購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；PCR擴(kuò)增引物由大連寶生物工程有限公司合成；碘化丙啶購(gòu)自Sigma公司；溴化乙錠購(gòu)自Amresco公司；TRIzol試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司；氯仿、異丙醇和乙醇均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將HepG-2細(xì)胞接種于含10%新生牛血清的低糖IMDM培養(yǎng)基中。于CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、37 ℃且飽和濕度的溫箱中培養(yǎng)。每2 d更換1次培養(yǎng)基，細(xì)胞長(zhǎng)至鋪滿瓶底約90%時(shí)用0.25%胰蛋白酶消化后傳代。

1.3 MTT法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的增殖

用0.25%胰蛋白酶消化處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG-2細(xì)胞，用單純培養(yǎng)液配成單個(gè)懸浮細(xì)胞(濃度為5×104/mL)，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積為100 μL，每組設(shè)8個(gè)復(fù)孔，另設(shè)空白組(只加培養(yǎng)液不加細(xì)胞，其他實(shí)驗(yàn)步驟保持一致，最后比色時(shí)，以空白組孔調(diào)零)。在溫箱溫育24 h后去原培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組分別加入ELE至200 μL/孔，使其濃度分別為20、40、60、80、100、120、140、160、180及200 μg/mL，另設(shè)對(duì)照組(培養(yǎng)液ELE為0)。將細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、48及72 h。在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的前4 h每孔加入MTT液20 μL(5 mg/mL)，避光繼續(xù)溫育，4 h后用1 mL注射器小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入二甲基亞砜(DMSO)150 μL，震蕩6 min使結(jié)晶完全溶解，于酶標(biāo)儀570 nm波長(zhǎng)下，以空白孔調(diào)零，測(cè)定各孔吸光值(D)。按公式計(jì)算不同濃度藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率(IR)及半數(shù)抑制濃度(IC50)，繪制劑量效應(yīng)曲線及時(shí)效曲線。IR(%)=(D對(duì)照組-D試驗(yàn)組)/(D對(duì)照組-D空白組)×100%；以藥物濃度為橫軸，細(xì)胞抑制率為縱軸，根據(jù)量效曲線計(jì)算半數(shù)抑制濃度(IC50值)。 實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期

調(diào)細(xì)胞濃度至1×106/mL接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，將HepG-2細(xì)胞分為4組，分別為對(duì)照組(未加藥物)和3個(gè)實(shí)驗(yàn)組(ELE濃度為20、40和60 μg/mL)。細(xì)胞處理后置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，0.25%的胰蛋白酶消化，離心(560×g)5 min，棄上清液，冷PBS洗2次，重懸于70%冷乙醇中，充分混勻，4 ℃固定過夜。加入25 μL RNaseA，置于37 ℃30 min，再加入25 μL PI染料，4 ℃避光靜置30 min，在流式細(xì)胞儀(FACS Vantage SE)上進(jìn)行周期分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 RT-PCR 檢測(cè)TOPOⅠmRNA含量

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞調(diào)濃度至5×105/mL接種于25 cm2培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，設(shè)立對(duì)照組(未加藥物)和實(shí)驗(yàn)組(ELE濃度為20、40和60 μg/mL)，培養(yǎng)48 h后收集各組細(xì)胞，采用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA(按TRIzol 抽提試劑說明書進(jìn)行)。RT-PCR步驟按照TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0說明書進(jìn)行，將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)，β-actin為內(nèi)參照。TOPOⅠ引物序列為：上游引物：5’-CGCTATCCTGAAGGCATCAA-3’；下游引物：5’-CTGGAGGAGGAGAAGGAACC-3’。擴(kuò)增產(chǎn)物為565 bp。β-actin引物序列：上游引物5’-GGACTTCGAGCAAGAGATGG-3’；下游引物：5’-ACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物為404 bp。TOPOⅠ按以下條件進(jìn)行PCR反應(yīng)：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸6 min。β-actin按以下條件進(jìn)行PCR反應(yīng)：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃終延伸5 min。將擴(kuò)增的RTPCR產(chǎn)物在1×TAE緩沖液中1.5%瓊脂糖凝膠電泳30 min，電壓控制在 90 V，UVP凝膠成像及分析系統(tǒng)觀察、拍照、分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 TOPOⅠ介導(dǎo)的解旋作用

反應(yīng)體系的組成：PBR322DNA 0.5 μg，TOPOⅠ Buffer 2 μL，TOPOⅠ 1 U(1 U定義為在標(biāo)準(zhǔn)的反應(yīng)條件下使0.01 μg/μL負(fù)超螺旋PBR322完全解旋的酶量)，0.1% BSA 2 μL，不同濃度的ELE 4 μL為實(shí)驗(yàn)組，不同濃度的HCPT 4 μL為陽性對(duì)照組，雙蒸水補(bǔ)足至20 μL。37 ℃溫育30 min后，加入1 μL的終止液(1% SDS，50%甘油，0.05%溴酚藍(lán))，在1×TAE緩沖液中1.5%瓊脂糖凝膠電泳30 min，電壓控制在136 V。電泳結(jié)束后，0.5 μg/mL溴化乙錠(ethidium bromide，EB)染色30 min，UVP凝膠成像及分析系統(tǒng)觀察、拍照、分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 ELE對(duì)DNA的直接作用

反應(yīng)體系的組成：PBR322DNA 0.5 μg，TOPOⅠ Buffer 2 μL，不同濃度的ELE 4 μL為實(shí)驗(yàn)組，以PBR322DNA為陰性對(duì)照組，雙蒸水補(bǔ)足至20 μL。37 ℃溫育30 min，加入1 μL的終止液(1% SDS，50%甘油，0.05%溴酚藍(lán))，電泳，染色及拍照同上，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 11.5軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)符合正態(tài)分布資料的均數(shù)用表示。對(duì)多組均數(shù)比較采用單因素多水平設(shè)計(jì)定量資料的方差分析，并通Dunnett檢驗(yàn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的兩兩比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。［(21.47±0.59)%］(P＜0.05)，呈現(xiàn)劑量依賴性(圖2)。

2 結(jié) 果

2.1 MTT法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)

隨著藥物濃度及作用時(shí)間增加，細(xì)胞增殖能力逐漸下降，表現(xiàn)為時(shí)間和劑量依賴性；藥物作用24、48和72 h 后，IC50值分別為96.13、80.84和60.95 μg/mL(圖1)。

2.2 ELE對(duì)HepG-2細(xì)胞周期的影響

藥物作用48 h后，實(shí)驗(yàn)組(ELE濃度分別為20、40和60 μg/mL)的S期細(xì)胞比例［(42.36±3.40)%、(47.86±4.83)%和(6 0.9 5±4.6 1)%］顯著高于對(duì)照組

2.3 ELE對(duì)HepG-2細(xì)胞TOPOⅠmRNA 表達(dá)的影響

藥物作用48 h后，實(shí)驗(yàn)組(ELE濃度分別為20、40和60 μg/mL)TOPOⅠmRNA與β-actin mRNA條帶灰度比值(0.84±0.08、0.68±0.01和0.58±0.04)顯著低于對(duì)照組(1.10±0.06)(P＜0.05)，提示ELE可抑制TOPOⅠ轉(zhuǎn)錄，并呈劑量依賴性(圖3)。

2.4 ELE對(duì)TOPOⅠ介導(dǎo)的負(fù)超螺旋PBR322DNA解旋作用的影響

TOPOⅠ切斷DNA雙鏈中的一股，使DNA雙鏈在解鏈旋轉(zhuǎn)中不致打結(jié)，適當(dāng)時(shí)候又把切口封閉，使DNA變?yōu)樗沙跔顟B(tài)，從而可催化超螺旋的DNA松弛解旋。采用TOPOⅠ介導(dǎo)的負(fù)超螺旋PBR322DNA解旋作用，觀察ELE對(duì)TOPOⅠ活性的影響。如圖4所示，泳道1是負(fù)超螺旋PBR322DNA(supercoiled DNA，S)；泳道2是加酶反應(yīng)后，超螺旋解旋成為松散型DNA(Relaxed DNA，R)；泳道3、4是為陽性對(duì)照組，在HCPT(典型的TOPO I 抑制劑)濃度為5 μg/mL時(shí)對(duì)TOPOⅠ介導(dǎo)的解旋反應(yīng)無抑制作用，在濃度為1 μg/μL時(shí)完全抑制了TOPOⅠ對(duì)PBR322 DNA的解旋作用；泳道5是HCPT 1 μg/μL聯(lián)合ELE 40 μg/mL對(duì)TOPOⅠ介導(dǎo)的負(fù)超螺旋PBR322DNA解旋作用的影響，如圖可見抑制了TOPOⅠ的活性。泳道6～11是不同濃度的ELE對(duì)TOPOⅠ介導(dǎo)的負(fù)超螺旋PBR322DNA解旋作用的影響。結(jié)果表明，ELE 40、60、80和100 μg/mL組對(duì)TOPOⅠ的活性有抑制作用，掃描其光密度最大值分別為(58±3、80±6、92±10和134±12)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析顯示，ELE 100 μg/mL組與40、60和80 μg/mL組相比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，ELE對(duì)TOPOⅠ的活性有抑制作用，其抑制作用具有劑量依賴性(圖4)。

圖 3 ELE作用于人肝癌HepG-2細(xì)胞48 h后TOPOⅠmRNA表達(dá)的變化Fig.3 TOPOⅠ mRNA expression of human hepatocellular carcinoma HepG-2 cells interfered by ELE for 48 h

圖 4 ELE抑制TOPOⅠ介導(dǎo)的負(fù)超螺旋PBR322DNA的解旋作用Fig.4 Inhibition of ELE on TOPOⅠ-mediatedunwinding effect of negative supercoil PBR322DNA

2.5 ELE對(duì)負(fù)超螺旋PBR322DNA無直接抑制作用

采用負(fù)超螺旋PBR322DNA觀察ELE對(duì)DNA的直接作用。結(jié)果表明，對(duì)照組及各藥物組平均光密度值分別為(22 860±2 412、24 572±518、22 318±651、22 781±837、20 781±1 180和24 284±749)，各組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，提示ELE不能直接引起負(fù)超螺旋PBR322DNA的雙鏈斷裂，對(duì)DNA不能產(chǎn)生直接的作用(圖5)。

圖 5 ELE對(duì)負(fù)超螺旋PBR322DNA的直接作用Fig.5 Direct effect of ELE on negative supercoil PBR322DNA

3 討 論

原發(fā)性肝癌是人類惡性腫瘤死亡因素的重要構(gòu)成，發(fā)病率與死亡率呈上升趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅人類健康。目前缺乏有效的治療措施，作為化療非敏感腫瘤，肝癌目前化療藥物有效率＜20%［4］。索拉非尼、厄洛替尼等靶向藥物在肝癌中的療效尚處臨床觀察階段［5］，雖然索拉非尼是第一個(gè)被臨床證實(shí)能夠輕度延長(zhǎng)肝癌患者生存期的藥物，然而有效率低，不良反應(yīng)有別于化學(xué)藥物，臨床尚處于認(rèn)識(shí)階段，因出現(xiàn)藥物所致死亡病例，限制了索拉非尼的臨床應(yīng)用，探索高效低毒的抗肝癌藥物是基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床醫(yī)學(xué)關(guān)注的熱點(diǎn)。

從天然藥物中篩選高效低毒的抗腫瘤藥物是獲取抗腫瘤藥物的基本策略。ELE是從我國(guó)傳統(tǒng)中藥溫莪術(shù)中提取的抗癌單體，臨床抗腫瘤療效評(píng)價(jià)良好，尤其對(duì)化療非敏感腫瘤肝癌表現(xiàn)出抑癌效果［6］。臨床報(bào)道表明，應(yīng)用ELE肝動(dòng)脈栓塞治療中晚期肝癌療效理想，可顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)，提高患者生存質(zhì)量，并顯示出生存優(yōu)勢(shì)，與化療聯(lián)合應(yīng)用表現(xiàn)出協(xié)同抗腫瘤作用，并降低了化療不良反應(yīng)［7］?；A(chǔ)研究表明ELE能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，干擾信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，抑制腫瘤轉(zhuǎn)移等抗腫瘤作用［8］。然而有關(guān)ELE對(duì)TOPO的作用未見報(bào)道。

TOPO是調(diào)節(jié)核酸拓?fù)錁?gòu)型的關(guān)鍵酶，其催化單鏈或雙鏈DNA短暫分離以利于復(fù)制。按其誘導(dǎo)DNA斷裂機(jī)制的不同分為TOPOⅠ和TOPOⅡ(TOPOⅡα、TOPOⅡβ)兩類［9］。TOPOⅠ是生物體內(nèi)廣泛存在的一類必需酶，參與DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、重組和修復(fù)等所有關(guān)鍵的核過程［10］。該類酶通過調(diào)節(jié)超螺旋、連鎖/去連鎖以及核酸解結(jié)作用，影響DNA拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)［11］。TOPOⅠ是S期關(guān)鍵酶，對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖起到至關(guān)重要作用，是目前一線抗腫瘤藥物如HCPT、拓?fù)涮婵导耙亮⑻婵档乃幮О悬c(diǎn)，干擾TOPOⅠ表達(dá)是目前抗癌藥物的重要作用機(jī)制［12］。本研究發(fā)現(xiàn)，ELE能夠抑制人肝癌HepG-2細(xì)胞增殖，呈時(shí)間與劑量依賴性特征，并可將HepG-2細(xì)胞阻滯于S期。DNA復(fù)制是S期的主要事件，作為調(diào)節(jié)核酸拓?fù)錁?gòu)型的關(guān)鍵酶，TOPOⅠ在S期DNA復(fù)制過程起重要作用，因而，干擾TOPOⅠ可能影響S期細(xì)胞生命活動(dòng)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞S期阻滯，從而啟動(dòng)腫瘤細(xì)胞的凋亡過程。研究表明ELE能夠影響肝癌細(xì)胞凋亡相關(guān)基因、熱休克蛋白及其相關(guān)調(diào)控因子基因的表達(dá)，抑制肝癌細(xì)胞遷移、侵襲等［13-14］，表現(xiàn)為多靶位的抗肝癌作用。我們的研究首次表明干擾TOPOⅠ表達(dá)及活性可能為ELE抑制肝癌的作用靶位，ELE是值得關(guān)注的抗肝癌藥物。

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