組蛋白去乙?；?在非小細(xì)胞肺癌遷移中的作用研究

洪偉俊 寧允葉 胥武劍 邵艷 李強(qiáng)

第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院呼吸內(nèi)科，上海 200433

肺癌是死亡率極高的惡性腫瘤，其中80%為非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)，只有20%～30%的患者有手術(shù)機(jī)會(huì)，但是即使是在手術(shù)切除的早期NSCLC患者中，也有三分之二的患者存在復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)，5年生存率仍然較低(8%～14%)。叢蕾等［1］研究發(fā)現(xiàn)，晚期NSCLC患者單純化療后中位生存期僅為12.2個(gè)月，1年生存率只有52.9%，復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移仍是導(dǎo)致死亡的主要因素。目前針對(duì)肺癌的主要治療手段——放療、化療等對(duì)提高肺癌患者的生存率已達(dá)到一個(gè)平臺(tái)期，深入探討肺癌發(fā)生、發(fā)展的分子生物學(xué)機(jī)制，以尋找新的安全有效的治療途徑、改善預(yù)后成為腫瘤研究的熱點(diǎn)。

組蛋白乙酰化狀態(tài)是調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵，而組蛋白乙酰化水平受組蛋白去乙?；?histone deacetylases，HDACs)和組蛋白乙?；?histone acetyltransferases，HATs)調(diào)節(jié)，HDACs和HATs失衡是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要分子機(jī)制。組蛋白去乙酰化酶5(histone deacetylase 5，HDAC5)是Verdel等［2］于1999年在小鼠基因組中發(fā)現(xiàn)的。人HDAC5基因定位于染色體17q21，廣泛表達(dá)于肺、腦、心肌、骨骼肌、胎盤等多種組織。HDAC5在多種腫瘤中表達(dá)降低，但其在肺癌細(xì)胞遷移中的作用尚未見報(bào)道。本研究旨在檢測(cè)肺癌組織及其相對(duì)應(yīng)的癌旁組織中HDAC5基因表達(dá)情況；體外利用HDAC5基因過表達(dá)質(zhì)粒，研究HDAC5對(duì)肺腺癌細(xì)胞NCI-H1299遷移的影響。

1 資料和方法

1.1 患者一般資料

所有標(biāo)本均來自我院2009年4月—2009年11月間手術(shù)的NSCLC患者，其中男性15例，女性13例；腺癌20例，鱗癌8例；年齡41～70歲，平均年齡為57.8歲。在手術(shù)切除病灶后用鋒利刀片迅速切取原發(fā)腫瘤和距離切緣2 cm處癌旁組織各1塊，組織標(biāo)本凍存于液氮中。

1.2 主要試劑

NCI-H1299細(xì)胞(購自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所)；胎牛血清(Hyclone)；高糖DMEM培養(yǎng)基(Hyclone)、OPTI-MEMⅠ培養(yǎng)基(Gibco)；兔抗人-HDAC5(SAB)；辣根過氧化酶(HRP)標(biāo)記的兔抗人GAPDH抗體(康成生物)；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(Abcam)；RNA提取試劑盒(TRIzol)(Invitrogen)，RT-PCR試劑盒(Takara)，real time-PCR試劑盒(Takara)；HDAC5野生型基因質(zhì)粒(pDEST26-HDAC5wt)由澳大利亞迪肯大學(xué)Sean L.McGee教授惠贈(zèng)。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

NCI-H1299細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中，37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、相對(duì)濕度為90%的溫箱(Heraus)內(nèi)培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)80%以上時(shí)0.25%胰酶消化傳代。

1.3.2HDAC5基因轉(zhuǎn)染及篩選

將NCI-H1299細(xì)胞接種于24孔板中，每孔為5×105個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞融合至80%以上，用Fugene HD試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)分組：轉(zhuǎn)染HDAC5wt基因的實(shí)驗(yàn)組(HDAC5wt)、未轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒的正常對(duì)照組(control)、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的陰性對(duì)照組(vector)。用OPTI-MEMⅠ培養(yǎng)基稀釋質(zhì)粒DNA至濃度為：2 μg DNA/100 μL OPTIMEMⅠ培養(yǎng)基，分別以Fugene HD轉(zhuǎn)染試劑：DNA比例為2∶2、4∶2、6∶2配制轉(zhuǎn)染復(fù)合物，室溫下溫育15 min，將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入到培養(yǎng)細(xì)胞中，OPTI-MEM Ⅰ培養(yǎng)6～8 h后換成含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后收集細(xì)胞提取蛋白。再以選定的最佳轉(zhuǎn)染比例轉(zhuǎn)染NCI-H1299細(xì)胞，36 h時(shí)加入含1 000 μg/mL G418和10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行選擇性培養(yǎng)，3周后篩選出陽性克隆擴(kuò)增培養(yǎng)，并用500 μg/mL的G418維持篩選。

1.3.3 凍存組織處理

于液氮中取出標(biāo)本，剪取少許組織并加入液氮后快速研磨，收集于2 mL EP管，分別加入TRIzol及RIPA蛋白裂解液后勻漿，提取mRNA、蛋白質(zhì)，分別進(jìn)行real time RT-PCR、Western blot實(shí)驗(yàn)。

1.3.4 Real time RT-PCR檢測(cè)HDAC5 mRNA表達(dá)

用TRIzol法抽提總mRNA，測(cè)定其濃度和純度，用RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。HDAC5上游引物：5’-CCATCAGCCAGAAGATGTATGC-3’，下游引物： 5’-ATTCCTCGGCGTGGTGTCCT-3’，PCR產(chǎn)物201 bp；β-actin上游引物：5’-GGACTTCGAGCAAGAGATGG-3’，下游引物： 5’-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3’，PCR產(chǎn)物 234 bp。PCR條件：94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火延伸40 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸5 min。

1.3.5 Western blot檢測(cè)HDAC5蛋白

RIPA蛋白裂解液裂解細(xì)胞及組織，4 ℃、134 000×g離心20 min，取上清液即為蛋白提取物。用BCA法測(cè)定蛋白濃度，30 μg變性蛋白聚丙烯酰胺(PAGE，10%)凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，5% BSA封閉，1∶1 000一抗4 ℃過夜，1∶2 000山羊抗兔HRP標(biāo)記二抗室溫反應(yīng)1 h ，ECL顯色，成像。

1.3.6 MTT比色法測(cè)定細(xì)胞增殖

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的H1299細(xì)胞(HDAC5wt)、空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞(vector)、未轉(zhuǎn)染細(xì)胞(control)融合達(dá)80%以上時(shí)，胰酶消化后形成單細(xì)胞懸液，以每孔5 000個(gè)細(xì)胞接種于 96孔板中，每組設(shè)10個(gè)復(fù)孔，分別于第1～5天時(shí)檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。細(xì)胞貼壁后進(jìn)行初始490 nm波長(zhǎng)光下的吸光度(D490)測(cè)定，之后分別于第1～5天分別測(cè)定各組細(xì)胞的D490值：每孔加入100 μL MTT液培養(yǎng)4 h后，去除培養(yǎng)基，加入DMSO 150 μL，室溫下充分震蕩10 min，用酶標(biāo)儀測(cè)定D490。重復(fù)3次。

1.3.7 Transwell實(shí)驗(yàn)

分別將已融合至80%以上的3組細(xì)胞進(jìn)行胰酶消化，形成單細(xì)胞懸液，872×g離心5 min后以無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，取200 μL無血清單細(xì)胞懸液(2×105個(gè)細(xì)胞)接種至置于24孔板內(nèi)的8 μm PET膜的transwell 小室中，外室中加入含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，溫箱中溫育8 h取出，中性甲醛固定30 min，用棉簽小心擦去上層未遷移細(xì)胞，用瑞氏染色、拍照，鏡下計(jì)數(shù)6個(gè)視野中已跨膜遷移的細(xì)胞數(shù)目。

1.3.8 劃痕實(shí)驗(yàn)

以每孔2×106個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中，當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)90%～100%時(shí)，棄去培養(yǎng)基，以無菌PBS清洗細(xì)胞1次后，用200 μL槍頭沿孔直徑筆直劃痕，用無菌PBS洗細(xì)胞3次，去除劃下的細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)，分別在0、12、24 h觀察、拍照。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所得數(shù)據(jù)用表示，應(yīng)用SPSS 11.5軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩樣本均數(shù)間比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，組間差異采用單因素方差分析(One Way ANOVA)，差異顯著者采用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行兩組間比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HDAC5在肺癌組織標(biāo)本中的表達(dá)

Real-time RT-PCR結(jié)果顯示，28例組織標(biāo)本中有20例肺癌組織中HDAC5 mRNA表達(dá)低于癌旁組織，其余8例HDAC5 mRNA表達(dá)稍微升高或無明顯差異(圖1)。Western blot檢測(cè)NSCLC及癌旁組織HDAC5蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示，與癌旁組織相比，肺癌組織中HDAC5的蛋白表達(dá)明顯降低(圖2)，其表達(dá)趨勢(shì)與mRNA表達(dá)一致，提示HDAC5在NSCLC中的低表達(dá)可能與NSCLC的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。

2.2 體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染中轉(zhuǎn)染試劑與質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染比例篩選

分別以Fugene HD轉(zhuǎn)染試劑與質(zhì)粒比例為 2∶2、4∶2、6∶2配制轉(zhuǎn)染復(fù)合物，轉(zhuǎn)染NCI-H1299細(xì)胞，如圖3所示，3種比例的轉(zhuǎn)染試劑都成功將HDAC5wt基因轉(zhuǎn)入目的細(xì)胞，其中4∶2組轉(zhuǎn)染效率明顯高于2∶2組，即前者HDAC5蛋白表達(dá)量高于后者；而6∶2組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，HDAC5蛋白表達(dá)量與4∶2組相近。因此，采用Fugene HD轉(zhuǎn)染試劑∶質(zhì)粒=4∶2的轉(zhuǎn)染比例進(jìn)行后續(xù)相關(guān)研究。

2.3 基因過表達(dá)鑒定

分別將HDAC5wt質(zhì)粒及空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入NCI-H1299細(xì)胞后，用G418進(jìn)行篩選，形成穩(wěn)定表達(dá)株。與未轉(zhuǎn)染組及空質(zhì)粒組相比，HDAC5wt組細(xì)胞中HDAC5的轉(zhuǎn)錄水平顯著提高(圖4)，蛋白表達(dá)量明顯增加(圖5)。

2.4 HDAC5基因?qū)1299細(xì)胞增殖的影響

采用MTT法檢測(cè)control、vector、HDAC5wt質(zhì)粒轉(zhuǎn)染3組細(xì)胞增殖情況，細(xì)胞貼壁后3組細(xì)胞初始D490值無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明3組細(xì)胞接種數(shù)量一致。在24 h時(shí)，3組間D490無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；在第2～5 天對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞D490值較正常對(duì)照組及陰性對(duì)照組顯著降低，而正常對(duì)照組與陰性對(duì)照組之間D490在同一檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)無顯著性差異(圖6)。

2.5 HDAC5過表達(dá)對(duì)H1299細(xì)胞遷移的影響

我們采用Transwell檢測(cè)HDAC5基因?qū)1299細(xì)胞跨膜遷移能力的影響。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組(158.3±19.4)跨膜遷移細(xì)胞數(shù)顯著低于正常對(duì)照組(247.0±12.1)及陰性對(duì)照組(236.0±14.9，P均＜0.05)，而正常對(duì)照組與陰性對(duì)照組間穿膜細(xì)胞數(shù)無顯著差異，提示HDAC5過表達(dá)抑制了NCI-H1299細(xì)胞跨膜遷移能力。

同時(shí)，我們采用劃痕實(shí)驗(yàn)直觀地觀察HDAC5基因?qū)1299細(xì)胞遷移能力的影響。結(jié)果如圖7所示，與初始劃痕寬度相比，在24 h內(nèi)3組細(xì)胞的劃痕都有不同程度的愈合。HDAC5組細(xì)胞在24 h時(shí)劃痕愈合程度明顯低于其他兩組，表明該組細(xì)胞的遷移能力低于其他兩組，從另一個(gè)角度證實(shí)了HDAC5基因過表達(dá)抑制NCI-H1299細(xì)胞遷移。

3 討 論

HDACs和HATs在腫瘤細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起重要作用。HDACs使組蛋白去乙?；蠡謴?fù)帶正電荷的特性，并與帶負(fù)電的DNA緊密結(jié)合，染色質(zhì)呈致密卷曲的阻抑結(jié)構(gòu)，從而抑制基因轉(zhuǎn)錄；HATs通過在組蛋白的N-端賴氨酸殘基上引入乙酰基，促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄。兩者在體內(nèi)處于一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡，共同參與基因的表達(dá)調(diào)控。一旦這種平衡破壞，細(xì)胞便異常增殖、分化，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展。HDACs在不同腫瘤中存在差異性表達(dá)，其中大多數(shù)亞型在多種腫瘤中呈高表達(dá)狀態(tài)：HDAC1在肺癌、前列腺癌、胃癌、結(jié)腸癌和乳腺癌中高表達(dá)［3］，HDAC2在胃癌、結(jié)直腸癌和宮頸癌中高表達(dá)［4-5］；目前僅發(fā)現(xiàn)HDAC5在多種腫瘤中低表達(dá)。Osada等［6］報(bào)道HDAC5基因表達(dá)與NSCLC預(yù)后顯著相關(guān)，HDAC5表達(dá)降低的患者其預(yù)后較差。本研究檢測(cè)了HDAC5在28例NSCLC組織及相應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)，結(jié)果證實(shí)HDAC5在癌組織較對(duì)應(yīng)的癌旁組織表達(dá)明顯降低，提示HDAC5基因的低表達(dá)可能在NSCLC的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。Urbich等［7］的研究表明HDAC5抑制血管形成，因此推測(cè)HDAC5可能與肺癌的轉(zhuǎn)移相關(guān)。

將HDAC5質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至人肺腺癌細(xì)胞NCI-H1299，分別采用Transwell方法研究細(xì)胞跨膜遷移能力、采用劃痕方法研究細(xì)胞側(cè)向遷移能力，結(jié)果表明，HDAC5基因過表達(dá)抑制H1299細(xì)胞遷移。由于在24 h時(shí)過表達(dá)HDAC5基因并未影響H1299細(xì)胞的增殖能力，因此排除了細(xì)胞遷移研究中因過表達(dá)HDAC5基因后細(xì)胞增殖差異對(duì)跨膜遷移細(xì)胞量及劃痕愈合能力的影響，從而證實(shí)HDAC5基因抑制H1299細(xì)胞遷移。

HDAC5蛋白上有多個(gè)基序：核定位信號(hào)基序(NLS)、出核信號(hào)基序(NES)、C-末端結(jié)合蛋白基序(CtBP)、肌增強(qiáng)子2結(jié)合基序(MEF2)、14-3-3伴侶蛋白結(jié)合基序、酶活性區(qū)域(DAC)等，HDAC5在不同的生理病理過程中發(fā)揮不同作用，參與這一過程的基序有所差異。HDAC5被磷酸化后可以在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)之間穿梭運(yùn)動(dòng)。Urbich、Roy等［7-8］研究表明，HDAC5及其磷酸化后的核定位在腫瘤細(xì)胞的增殖、血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移過程中起重要作用。而多種因素參與或影響HDAC5的磷酸化及其核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)過程，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、Ga13蛋白、血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)、流體剪切力等［9-11］。然而HDAC5抑制NCI-H1299細(xì)胞遷移是否與其磷酸化后的核定位或核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)尚需進(jìn)一步探討。

綜上，本研究結(jié)果顯示HDAC5基因在NSCLC中低表達(dá)；HDAC5基因過表達(dá)后抑制H1299細(xì)胞遷移，提示HDAC5基因可能參與NSCLC的轉(zhuǎn)移，為NSCLC患者晚期轉(zhuǎn)移的防治提供一種新的思路，為抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移提供一個(gè)新的靶點(diǎn)。

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