甲狀腺乳頭狀癌組織中瘦素的表達與血管生成及轉(zhuǎn)移的關(guān)系

于霄 趙俊軍 王波 李連宏 李平 唐建武 孫雷

1.大連醫(yī)科大學(xué)中日臨床病理中心，遼寧 大連 116044；

2.大連市中心醫(yī)院，遼寧 大連 116033

1994年瘦素(leptin)和ob基因(obese gene)的發(fā)現(xiàn)，1995年leptin受體OB-R的成功克隆將leptin這一物質(zhì)引入人們的視線。隨著對leptin認識的逐漸加深，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)，leptin不僅與肥胖癥有關(guān)，也通過不同的信號通路及途徑參與結(jié)腸癌、肝癌、口腔鱗癌、宮頸癌等惡性腫瘤進展過程［1-5］。血管生成對腫瘤的發(fā)展至關(guān)重要，研究表明leptin有促進血管生成的作用［6］。本實驗采用免疫組織化學(xué)染色法檢測甲狀腺乳頭狀癌組織中l(wèi)eptin的表達情況及其與血管生成、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

1 資料和方法

1.1 資料來源

收集大連市中心醫(yī)院病理科2003—2009年甲狀腺乳頭狀癌組織標(biāo)本58例(其中已發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移29例，未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移29例)和甲狀腺腺瘤組織標(biāo)本26例。

1.2 切片及染色

選定標(biāo)本經(jīng)常規(guī)4%甲醛固定，將其切片，片厚約4 μm，切片經(jīng)常規(guī)脫蠟、水化后，進行HE染色及免疫組織化學(xué)染色。

1.3 分組方法

根據(jù)病理診斷將標(biāo)本分為甲狀腺乳頭狀癌組、對照組(癌旁組、甲狀腺腺瘤組)。

1.4 免疫組織化學(xué)染色

試劑：兔抗人leptin多克隆抗體ob購自Santa Cruz公司。鼠抗人CD105單克隆抗體和SP試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。免疫組織化學(xué)染色步驟按照SP法。

leptin陽性結(jié)果判定：參照許良中等［7］的免疫組織化學(xué)反應(yīng)結(jié)果的判定標(biāo)準，綜合考慮切片中陽性細胞占所觀察同類細胞數(shù)的百分比。陽性細胞百分比分為4級：≤5%為0分；＞5%～25%為1分；＞25%～50%為2分；＞50%為3分。根據(jù)顯色程度判定陽性強度：基本不著色為0分；淡黃色為1分；棕黃色為2分；棕褐色為3分。將每張切片著色程度得分與著色細胞百分率得分相乘，為最后得分。0～1分為陰性(-)；2～3分為弱陽性(＋)；4～6分為中等陽性(＋＋)；6分以上為強陽性(＋＋＋)。

C D 1 0 5標(biāo)記微血管，微血管密度(microvessel density，MVD)計數(shù)方法為：與背景明顯有別的任何一個被染成棕色的內(nèi)皮細胞或不管是否有腔的細胞叢均視為單個微血管，分支結(jié)構(gòu)如果未和連續(xù)結(jié)構(gòu)中斷應(yīng)作為一個血管計數(shù)，管徑大于8個紅細胞并具有肌層的血管不作為新生微血管，200倍下選取3個MVD高區(qū)，在200倍視野下由2名病理醫(yī)師采用雙盲法進行計數(shù)，結(jié)果取均值作為該病例的MVD。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件中的χ2檢驗、單因素方差分析和非參數(shù)等級相關(guān)性(Spearman)檢驗對數(shù)據(jù)進行分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組中l(wèi)eptin的表達情況

leptin主要表達于甲狀腺乳頭狀癌組織中、腫瘤細胞的胞質(zhì)內(nèi)、局部癌組織及周邊組織間質(zhì)內(nèi)(圖1)。甲狀腺乳頭狀癌組織leptin表達陽性率為91.38% (已轉(zhuǎn)移組93.10%，未轉(zhuǎn)移組89.66%，χ2=10.68，P＜0.05)，顯著高于甲狀腺腺瘤組織(leptin表達陽性率為7.70%，χ2=56.07，P＜0.05)和癌旁組織(leptin表達陽性率為5.17%，χ2=88.94，P＜0.05)。甲狀腺腺瘤組織與癌旁組織之間leptin表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=2.31，P＞0.05) (表1、2 )。

表 1 各組leptin表達陽性分析Tab.1 Statistic analysis of leptin-positive expression in different groups

表 2 甲狀腺乳頭狀癌組leptin表達情況Tab.2 The expression of leptin in thyroid papillary carcinoma group

2.2 各組CD105表達情況以及MVD計數(shù)結(jié)果

甲狀腺乳頭狀癌轉(zhuǎn)移組和未轉(zhuǎn)移組CD105表達如圖2所示。

經(jīng)單因素方差分析(表3)，甲狀腺乳頭狀癌已轉(zhuǎn)移組MVD(59.92±18.54)高于未轉(zhuǎn)移組(22.44±14.50，P=0.000)、腺瘤組(4.18±2.14，P=0.000)和癌旁組(2.03±1.52，P=0.000)；甲狀腺乳頭狀癌未轉(zhuǎn)移組MVD高于腺瘤組(P=0.005)和癌旁組(P=0.000)；腺瘤組與癌旁組MVD差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.919)。Spearman相關(guān)分析顯示，MVD隨leptin表達的強度增強而增加，兩者呈正相關(guān)性(r=0.88，P＜0.05)。

3 討 論

leptin是由ob基因編碼的146個氨基酸組成的多肽激素。leptin在最初的研究中是作為調(diào)節(jié)機體能量平衡的重要因子，隨后發(fā)現(xiàn)leptin與某些惡性腫瘤的進展有關(guān)。相關(guān)動物實驗提示由于肥胖引起的leptin血漿水平提高可增加黑色素瘤的生長速度［8］。臨床研究表明，循環(huán)血中l(wèi)eptin血漿濃度的提高可見于乳腺癌患者、兒童癌癥患者、兒童期急性淋巴細胞白血病患者等［9-12］。甲狀腺乳頭狀癌患者血漿中l(wèi)eptin濃度的明顯升高與本實驗結(jié)果中甲狀腺乳頭狀癌組織leptin的高表達一致［13］。此外，結(jié)腸癌、胃癌、宮頸癌組織中l(wèi)eptin的表達亦有增強［14-16］。在惡性腫瘤患者體內(nèi)血漿leptin濃度的升高、局部癌組織leptin的高表達不僅與脂肪的沉積和能量代謝有關(guān)，更受關(guān)注的效應(yīng)是改變惡性腫瘤組織局部環(huán)境進而通過復(fù)雜的機制參與腫瘤的進展。

表 3 各組新生血管密度以及與leptin表達的相關(guān)性分析Tab.3 The MVD in different groups and its correlation with leptin expression

一些體外研究證實leptin對于惡性腫瘤細胞的遷移起到促進作用。如leptin可刺激前列腺癌、結(jié)腸癌以及甲狀腺癌細胞的遷移［17-19］。遷移對于腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生有非常重要的作用。然而leptin并不是直接賦予惡性腫瘤細胞遷移的能力，而是通過使細胞外基質(zhì)金屬蛋白酶增多、經(jīng)激活的NF-κB通路誘導(dǎo)整聯(lián)蛋白高表達等途徑改變惡性腫瘤組織局部的細胞外基質(zhì)狀態(tài)，從而發(fā)揮促進細胞遷移的作用［20-21］。本實驗結(jié)果表明甲狀腺乳頭狀癌中，已發(fā)生轉(zhuǎn)移組的leptin表達強度強于未發(fā)生轉(zhuǎn)移組，據(jù)此可推測leptin通過復(fù)雜的途徑參與了甲狀腺乳頭狀癌組織的轉(zhuǎn)移過程。

無血管狀態(tài)下腫瘤的直徑不超過2～3 mm，因此腫瘤的發(fā)展依賴血管的生成。1998年，Sierra-Honigmann MR等［22］發(fā)現(xiàn)leptin受體可表達于人類脈管系統(tǒng)及原代培養(yǎng)的人類內(nèi)皮細胞，內(nèi)皮細胞作為leptin可作用的靶細胞在其調(diào)控下發(fā)生分裂增殖。leptin具有激活造血細胞的作用，并特定地調(diào)控內(nèi)皮祖細胞的黏附性及靶向歸巢能力［23-24］。另有研究表明，leptin還可誘導(dǎo)局部組織血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達［17］。leptin的這些作用均可促進腫瘤組織血管的新生。部分研究已經(jīng)證實肝癌、前列腺癌組織中l(wèi)eptin及其受體參與腫瘤組織血管的生成［17，25］。本實驗新生血管密度隨著leptin的表達強度的增加而增高，兩者呈正相關(guān)性。推測leptin參與了甲狀腺乳頭狀癌組織內(nèi)血管的生成，為腫瘤的發(fā)展提供基礎(chǔ)。

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