木賊中3種成分的HPLC-DAD-MS分析

許鑫 蘇瑞 金敏婷 張舒婷 陳榮 方洪壯

（1佳木斯大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007；2山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司，山東 濟(jì)寧 272000）

木賊為木賊科木賊(Equisetum hiemale L.)的干燥地上部分，現(xiàn)收載于《中國藥典》2010年版（一部）。木賊具有“疏散風(fēng)熱、明目、退翳”等傳統(tǒng)功效和多種藥理活性，主要含有酚酸類和黃酮類多種化學(xué)成分[1-3]?，F(xiàn)今，木賊的質(zhì)量控制方法，僅涉及其所含的黃酮苷或單一的黃酮苷元的含量測定[4-7]，而木賊中的酚酸類成分的含量測定尚未見報道。為了更全面地控制木賊藥材的質(zhì)量，本研究采用HPLC-DAD-MS/MS技術(shù)，通過木賊色譜峰的質(zhì)譜數(shù)據(jù)并結(jié)合文獻(xiàn)[8-10]，推斷化合物的歸屬，進(jìn)而與對照品的色譜、光譜、質(zhì)譜比對，確定了酚酸成分阿魏酸及2種黃酮苷元，蜀葵苷元與山柰素；建立了木賊中阿魏酸、蜀葵苷元及山柰素3種成分含量同時測定的HPLC多波長法。所建立木賊藥材中3種成分含量同時測定的方法，準(zhǔn)確可靠、靈敏度高，可供木賊質(zhì)量控制與評價參考。

1 儀器和材料

Agilent 1200系列高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國安捷倫儀器有限公司)，包括G1311A四元泵，G1322真空脫氣機(jī)，G1329自動進(jìn)樣器，G1315DAD檢測器，6310離子阱質(zhì)譜檢測器。木賊藥材6批，其中5批2008年購于國內(nèi)不同城市，1批2008年秋采自于黑龍江伊春地區(qū)，經(jīng)佳木斯大學(xué)藥學(xué)院宗希明高級實驗師鑒定為木賊科植物木賊（Equisetum hiemale L.）。阿魏酸、山柰素對照品（中國食品藥品檢定研究院）；蜀葵苷元對照品（上海永恒生物有限公司），純度99.8%；乙腈、甲醇為色譜純，甲酸、醋酸銨、鹽酸為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 測定條件

2.1.1 HPLC-DAD條件ZORBAX SB-C18色譜柱(250 mm× 4.6 mm，5 μm)；乙腈(A)－0.2%甲酸水(B)為流動相，梯度洗脫程序：0 ～ 10 min，18%(A)；10 ～ 20 min，18% ～38%(A)；20 ～ 27 min，38%(A)。柱溫 35℃，進(jìn)樣量 20 μL，檢測波長276、323 nm、366 nm。

2.1.2 HPLC-DAD-MS條件紫外檢測波長為282 nm，光譜波長記錄范圍210～400 nm，波長間隔2 nm。蜀葵苷元和山柰素的定性的色譜條件同“2.1.1”項，阿魏酸的定性時的流動相為甲醇－0.1%醋酸銨，洗脫梯度，47 min內(nèi)甲醇由5%線性升至100%。質(zhì)譜條件為：Turbo Ion spray(ESI源)，干燥氣的體積流量10 L/min，干燥氣的溫度350℃，霧化室壓力35.0 psi，掃描范圍m/z 50～1 000 amu；負(fù)離子模式檢測，多級反應(yīng)檢測掃描方式，柱后1∶1分流。

2.2 溶液的制備

2.2.1供試品溶液參照2010版中國藥典木賊的含量測定項下的提取方法[5]，取過三號篩的粉末約1.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入75%甲醇50 mL，密塞，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用75%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液20 mL，加鹽酸10 mL，置水浴中加熱水解1 h，放冷，轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，加75%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液。

2.2.2對照品溶液精密稱取阿魏酸、蜀葵苷元和山柰素對照品適量，以甲醇溶解制備混和對照品儲備液，阿魏酸、蜀葵苷元、山柰素濃度分別為0.10、0.16、0.50 mg/mL。避光冷藏。測定時，按所需濃度將儲備液用甲醇稀釋成對照品混合溶液。

2.3 定性分析

2.3.1蜀葵苷元與山柰素的定性取供試品溶液，按“2.1”項下HPLC-DAD-MS條件測定。供試液在282 nm下的色譜圖及供試液的質(zhì)譜總離子流圖見圖1。圖1中保留時間21.57 min化合物，準(zhǔn)分子離子峰為m/z 301[M-H]－，二級質(zhì)譜主要碎片離子為m/z 283[M-H-H2O]－、m/z 273[M-CO]－、m/z 245[M-CO-H2O]－、m/z 229[M-CO-H2O-O]，與文獻(xiàn)中報道的蜀葵苷元相一致[8]，推斷為蜀葵苷元。26.15 min的化合物，準(zhǔn)分子離子峰m/z 285[M-H]－、質(zhì)譜主要碎片離子為 m/z 267[M-H-H2O]－、m/z 257[M-H-CO]－、m/z 229[M-H-CO-CO]－、m/z210.9[M-H-HCOOH]、m/z184[M-H-C4H4O3]，與文獻(xiàn)中的山柰素質(zhì)譜數(shù)據(jù)相同[8]，推斷為山柰素。取對照品混合溶液，按供試液測定條件進(jìn)行測定，經(jīng)樣品中的初判化合物與相應(yīng)對照品的保留時間、紫外光譜和質(zhì)譜的比對，最終確定上述兩個化合物分別為蜀葵苷元和山柰素。

圖1 蜀葵苷元與山柰素定性時的木賊色譜圖(A)與總離子流圖(B)

2.3.2阿魏酸的定性按“2.2.1”項下的條件測定供試品溶液。供試液在282 nm下的色譜圖與供試液的質(zhì)譜總離子流圖見圖2。圖2中保留時間9.94 min化合物，準(zhǔn)分子離子峰為m/z 193[M-H]－，二級質(zhì)譜主要碎片離子為m/z 177.9[M-H-OCH3]－、m/z 133.9[M-H-OCH3-COO]－，與文獻(xiàn)中報道的阿魏酸一致[10]，初步將該化合物判為阿魏酸。另取對照品混合溶液，按上述條件測定，通過與對照品的保留時間、紫外光譜及質(zhì)譜數(shù)據(jù)的比較，確定該化合物為阿魏酸。

2.4 定量分析

2.4.1色譜系統(tǒng)適用性根據(jù)HPLC-DAD的紫外光譜圖，選定阿魏酸、蜀葵苷元、山柰素的最大吸收波長323、276、366 nm為測定波長，供試液在上述波長下的色譜圖見圖3。3種物質(zhì)的理論板數(shù)分別為13 002、115 936、121 641，分離度分別大于3.6、3.5、3.4。另取適當(dāng)濃度的對照品混合溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，及5 d分別進(jìn)樣，考察阿魏酸、蜀葵苷元、山柰素色譜峰的相對保留時間及峰面積的重復(fù)性，各峰相對保留時間及峰面積的日內(nèi)和日間RSD值見表1。由所測數(shù)據(jù)可知，色譜系統(tǒng)的各項指標(biāo)均滿足于定量要求。

圖2 阿魏酸定性時的木賊色譜圖(A)與總離子流圖(B)

圖3 供試品定量波長下的色譜圖

表1 阿魏酸、蜀葵苷元、山柰素的相對保留時間與峰面積重復(fù)性

2.4.2線性關(guān)系精密量取混合對照品儲備液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10 mL，分別置 100 mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，按設(shè)定的色譜條件測定峰面積。以阿魏酸、蜀葵苷元、山柰素質(zhì)量X對色譜峰面積Y計算回歸方程。阿魏酸、蜀葵苷元、山柰素分別在 0.02 ～ 0.2 μg、0.032 ～ 0.32 μg、0.1～1 μg范圍內(nèi)與各自的峰面積的線性關(guān)系良好，結(jié)果見表2。

2.4.3檢測限和定量限以甲醇逐級稀釋混合對照品儲備液，在選定色譜條件下測定。取信噪比S/N=3時的質(zhì)量為最低檢測限，S/N=10時的質(zhì)量為最低定量限。阿魏酸、蜀葵苷元和山柰素的最低檢測限和最低定量限見表2。

2.4.4穩(wěn)定性試驗取供試品溶液，室溫下放置，按上述色譜條件分別每間隔1 h進(jìn)樣測定，計算阿魏酸、蜀葵苷元及山柰素峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果表明，化合物阿魏酸、蜀葵苷元的峰面積值在4 h后開始減少，3種物質(zhì)在4 h內(nèi)峰面積的RSD分別為 1.40%，0.30%，0.10%。供試品溶液室溫條件下，4 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.5回收率試驗分別取已知含量的同一產(chǎn)地樣品6份，各約0.75 g，精密稱定。置具塞錐形瓶中，每份樣品加入4.5 mL混合對照品儲備液，水浴蒸干甲醇，精密稱定。按“2.2.1”項下自“精密加入 75%甲醇 50 mL”起操作，制備供試品溶液。按“2.1”項下色譜條件進(jìn)行分析測定，記錄峰面積，計算加樣回收率。阿魏酸、蜀葵苷元、山柰素的平均回收率分別為100.1%、99.4%、99.7%，RSD分別為0.89%、1.5%、1.3%。

表2 木賊藥材中3種成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢測限與定量限

2.4.6樣品的測定按供試品溶液制備方法及定量色譜條件，測定不同來源的6批木賊藥材中的3種成分的含量，結(jié)果見表3。

3 討論

3.1 以乙腈-0.2%甲酸水溶液為色譜流動相質(zhì)譜定性時，未檢測到阿魏酸?？赡茉诖藯l件下，阿魏酸未能離子化，得不到其母離子及其相關(guān)的碎片離子。因此，將甲酸改換為醋酸銨以促進(jìn)阿魏酸的離子化。又因以乙腈－醋酸銨水溶液為流動相時，阿魏酸與溶劑同時出峰，故采用甲醇－0.1%醋酸銨水溶液為流動相。

表3 6批木賊藥材3種成分的百分含量

3.2 定量分析時，為增強(qiáng)測定的靈敏性和選擇性，采用了多個波長同時測定的方法，測定波長分別選在阿魏酸、蜀葵苷元及山柰素的紫外最大吸收處的波長。

3.3 所測定的3種活性成分均為供試品溶液色譜中信號較強(qiáng)的化學(xué)物質(zhì)。木賊藥材中，經(jīng)HPLC-DAD-MS/MS定性分析雖有槲皮素等黃酮的存在，但色譜信號強(qiáng)度較阿魏酸、蜀葵苷元及山柰素低的多，難以與這3種活性成分同時定量。

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