管碟法測(cè)定抗生素效價(jià)的影響因素及控制方法

蔣惠嵐

(廣西壯族自治區(qū)獸藥監(jiān)察所，南寧 530001)

管碟法是國(guó)內(nèi)外常用的抗生素微生物檢定法［1］。其原理是根據(jù)抗生素在一定濃度范圍內(nèi)，對(duì)數(shù)劑量與抑菌圈直經(jīng)(面積)呈線性關(guān)系，比較標(biāo)準(zhǔn)品(S)與供試品(T)兩者對(duì)接種的特定試驗(yàn)菌的固體培養(yǎng)基內(nèi)呈球面形擴(kuò)散，形成含一定濃度抗生素球形區(qū)，抑制了試驗(yàn)菌的繁殖而呈現(xiàn)透明的抑菌圈大小，計(jì)算出供試品的效價(jià)［2］。因?yàn)樵囼?yàn)過(guò)程中影響結(jié)果的因素較多，任何一個(gè)環(huán)節(jié)操作不當(dāng)或疏忽就會(huì)造成很大誤差，甚至導(dǎo)致整組實(shí)驗(yàn)的失敗。筆者根據(jù)多年的工作實(shí)踐，對(duì)以下關(guān)鍵的影響因素進(jìn)行了試驗(yàn)研究，并提出控制方法，供同行參考。

1 實(shí)驗(yàn)器材的影響

1.1 實(shí)驗(yàn)環(huán)境的選擇 操作室要潔凈，室內(nèi)設(shè)有紫外燈，定期消毒，無(wú)抗生素的污染。操作臺(tái)面要求水平平整，最好用大理石臺(tái)面［2］。

1.2 實(shí)驗(yàn)器材的選擇 雙碟要求［2－4］碟底水平，無(wú)氣泡。鋼管要求［2］，內(nèi)外壁及兩端面光潔平坦，管壁厚薄一致，重量相等。鋼管二端面不夠平整可使抗生素溶液漏出，破壞均勻擴(kuò)散現(xiàn)象。鋼管重量相同，能保證均勻擴(kuò)散。移液管、容量瓶必須經(jīng)過(guò)檢定。

1.3 實(shí)驗(yàn)器材的清洗 玻璃雙碟和鋼管要特別注意清潔，如果因?yàn)榍逑床桓蓛舳鴼埩粲锌股鼗蚯鍧嵰旱任廴?，在下次?shí)驗(yàn)中造成抑菌圈不正常現(xiàn)象。玻璃雙碟和鋼管先滅菌再清洗，玻璃雙碟等其他玻璃容器最好用重鉻酸鉀硫酸洗液浸泡。鋼管最好定期加洗衣粉置超聲波清洗，再用流水多次沖洗干凈，最后用純化水沖洗3次。

2 試驗(yàn)菌的準(zhǔn)備及影響

要及時(shí)做好實(shí)驗(yàn)菌的傳代工作和和定期檢查工作。一旦發(fā)現(xiàn)菌種老化，必須進(jìn)行純化、復(fù)壯，若污染雜菌則廢棄不用，否則會(huì)引起抑菌圈不清晰，甚至無(wú)抑菌圈等異?，F(xiàn)象。從工作中我們總結(jié)出如下經(jīng)驗(yàn)，取純種的凍干菌種復(fù)蘇到營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，從第一代開(kāi)始從平板上挑選典型菌落接種至兩支營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面，1支作為工作用菌種留下一次接種用(保種)，置4℃冰箱保存，另1支作為制作菌懸液使用，如此反復(fù)。大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌可使用10代(每1個(gè)月傳代1次);短小芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌可使用5代(每6個(gè)月傳代1次)。制備好的芽孢菌懸液，置4℃冰箱保存，可使用6個(gè)月;金黃色葡萄球菌菌懸液，可使用1～2個(gè)月;藤黃微球菌菌懸液，可使用1～2個(gè)月;大腸桿菌菌懸液，可使用15～60 d。試驗(yàn)菌菌齡對(duì)抑菌圈邊緣的清晰度影響較大，筆者做過(guò)試驗(yàn)菌菌齡對(duì)抑菌圈的影響，當(dāng)天菌最清晰，15 d菌很清晰，30 d菌清晰，60 d菌清晰，90 d菌尚清晰，120 d菌欠清晰，150 d菌不清晰(芽孢菌除外)，甚至無(wú)抑菌圈，因此菌懸液的使用一般不超過(guò)3個(gè)月。

3 培養(yǎng)基對(duì)效價(jià)測(cè)定的影響

培養(yǎng)基有成品干粉培養(yǎng)基和自配培養(yǎng)基兩種。干粉培養(yǎng)基按比例加水配制調(diào)節(jié)pH值后滅菌，使用方便，目前多用。干粉培養(yǎng)基以中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所等的質(zhì)量較好，特別是粘菌素干粉培養(yǎng)基，其抑菌圈清晰透明。自配培養(yǎng)基時(shí)蛋白胨、瓊脂等的質(zhì)量影響較大。培養(yǎng)基中原材料質(zhì)量及培養(yǎng)基pH值對(duì)抑菌圈的邊緣清晰度和試驗(yàn)結(jié)果的精密度影響較大［2，5－6］，如自配粘菌素培養(yǎng)基，如原料選擇不當(dāng)，常導(dǎo)致抑菌圈清晰度差，因此應(yīng)對(duì)原材料進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，挑選適當(dāng)?shù)钠放啤?/p>

4 稱量

5 稀釋

宜采用容量瓶，稀釋步驟一般不得過(guò)3步，每步取樣量不得小于2 mL為宜。用吸管吸取溶液前，要用待稀釋液沖洗吸管2～3次，吸取溶液后，要用濾紙把吸管外壁多余液體擦去，再?gòu)钠鹗伎潭乳_(kāi)始垂直放溶液，一定要把液體放完，特別是油性的液體最后要使吸管碰壁并停留半分鐘。標(biāo)準(zhǔn)品與供試品溶解稀釋的時(shí)間、所用緩沖液應(yīng)盡量一致。

6 加菌懸液的加量是較關(guān)鍵的影響因素

新配制的菌懸液，正式試驗(yàn)前應(yīng)先進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，在上層培養(yǎng)基中分別加入不同濃度的菌懸液，以能使標(biāo)準(zhǔn)品高濃度所致的抑菌圈直徑在18～22 mm的菌液濃度為試驗(yàn)用濃度。批量試驗(yàn)中后期，菌懸液保存的時(shí)間過(guò)久，菌株就會(huì)逐漸衰亡，生長(zhǎng)周期不一致，其對(duì)抗生素的敏感度減小，導(dǎo)致抑菌圈變大、模糊或者出現(xiàn)雙圈(在供試品中含有兩種以上抗生素時(shí)也可以產(chǎn)生雙圈)。如若菌株不純，也會(huì)造成這樣的結(jié)果。因此，菌懸液在使用一段時(shí)間后，應(yīng)逐漸加大菌懸液的使用量，但菌液使用到一定時(shí)間后，菌種對(duì)抗生素不敏感，這時(shí)不能再盲目加大量使用，必須重新配制。試驗(yàn)過(guò)程中如果所生成的抑菌圈太小，要減小菌懸液的加入量;如果所生成的抑菌圈太大，要增加菌懸液的加入量。表1為常用抗生素效價(jià)測(cè)定菌層培養(yǎng)基的參考加菌量，可供抑菌圈預(yù)測(cè)實(shí)驗(yàn)時(shí)的參考。

表1 常用抗生素效價(jià)測(cè)定菌層培養(yǎng)基的參考加菌量

7 雙碟培養(yǎng)基的制備

7.1 底層培養(yǎng)基的制備 培養(yǎng)基在微波爐中完全熔化后，加注底層培養(yǎng)基20 mL均勻鋪滿整個(gè)雙碟，應(yīng)無(wú)氣泡，若有氣泡應(yīng)用吸管戳破。注意培養(yǎng)基溫度不可太低，應(yīng)控制在70℃以上，溫度太低培養(yǎng)基易析出及結(jié)塊，甚至不能使用。

7.2 菌層的制備 菌層制備時(shí)培養(yǎng)基溫度的掌握，一般菌(大腸桿菌等)培養(yǎng)基溫度控制48～52℃，芽孢菌培養(yǎng)基溫度控制50～65℃，溫度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致菌種死亡而無(wú)抑菌圈;溫度過(guò)低培養(yǎng)基會(huì)凝固，菌懸液與培養(yǎng)基不能混勻，在底層培養(yǎng)基上不能均勻攤布，產(chǎn)生的抑菌圈不規(guī)則，誤差增大。當(dāng)加入菌懸液混勻以后，應(yīng)盡快加注到底層培養(yǎng)基上，可直接用大口吸管吸取菌層培養(yǎng)基放在底層培養(yǎng)基雙碟的中間部位，再迅速轉(zhuǎn)動(dòng)雙碟，將培養(yǎng)基均勻攤布并鋪滿整個(gè)底層培養(yǎng)基，鋪好的培養(yǎng)基表面應(yīng)平整，如果不平整則加入鋼管中的抗生素溶液會(huì)從鋼管下緣流出，出現(xiàn)破圈，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。

8 放置小鋼管

盡量使用自動(dòng)鋼管放置器，以使鋼管之間的距離均勻，避免距離過(guò)小，導(dǎo)致抑菌圈相連。放好后靜置5 min，使之在瓊脂內(nèi)沉降穩(wěn)定，再開(kāi)始滴加抗生素溶液。

9 滴加抗生素溶液是最關(guān)鍵的影響因素

因?yàn)橥灰志鷿舛鹊目股?，其在鋼管中的量大，抑菌圈?量小，抑菌圈小。所以，每個(gè)鋼管中抗生素效價(jià)單位數(shù)應(yīng)盡量一致，以克服碟間差異，減小誤差。

9.1 膠頭滴管法(要求操作非常熟練)要按照SH→TH→SL→TL(二劑量法)滴加抗生素，滴加之前，滴管至少要用被滴加液體沖洗3次。在往小鋼管中滴加抗生素溶液時(shí)，由于滴管內(nèi)抗生素溶液往往會(huì)有氣泡或者滴管開(kāi)口端有液體殘留，繼續(xù)滴加容易造成氣泡膨脹破裂，使溶液濺落在菌層培養(yǎng)基表面造成破圈，也引起滴加體積不準(zhǔn)確，滴管內(nèi)千萬(wàn)不能有氣泡。因此一旦滴管中出現(xiàn)氣泡或者殘留，就重新吸取抗生素溶液進(jìn)行滴加。膠頭滴管管口應(yīng)避免太細(xì)或太粗，滴加時(shí)離開(kāi)鋼管口距離不要太高，以免液體濺出;也不能太低而碰倒鋼管。滴加中若有濺出，可用濾紙片或棉花輕輕吸去，不致造成破圈。在滴加中還有可能出現(xiàn)抗生素溶液滴入鋼管后，沒(méi)有與培養(yǎng)基菌層接觸，有一段空氣被壓在溶液與培養(yǎng)基之間(滴加抗生素溶液過(guò)快時(shí)容易形成)，導(dǎo)致培養(yǎng)后無(wú)抑菌圈的產(chǎn)生。此時(shí)可以小心的用滴管吸出鋼管內(nèi)的抗生素溶液，棄去，換滴管重新滴加。每次滴加抗生素溶液至鋼管口平滿。假如滴加過(guò)滿，可以用滴管吸出。滴加溶液間隔時(shí)間不可過(guò)長(zhǎng)，因?yàn)槿芤旱臄U(kuò)散時(shí)間不同影響測(cè)定結(jié)果。

9.2 移液槍(微量進(jìn)樣器)法 當(dāng)用移液槍滴加抗生素溶液時(shí)以加入270 μL的體積最為合適，可以獲得滿意的可信限率(≤5%)。經(jīng)過(guò)多次對(duì)比實(shí)驗(yàn)和多年的實(shí)踐驗(yàn)證用移液槍加樣更易操作和掌握，誤差更小，更準(zhǔn)確，可節(jié)約大量時(shí)間。建議把用移液槍滴加抗生素溶液的體積為270 μL寫(xiě)入《中國(guó)獸藥典》，以便于廣泛推廣應(yīng)用。

10 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)效價(jià)測(cè)定的影響

按各品種要求置36℃培養(yǎng)16～18 h，根據(jù)需要可適當(dāng)延長(zhǎng)1～2 h，以抑菌圈清晰為好。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)粘菌素、慶大霉素、泰樂(lè)菌素等可適當(dāng)延長(zhǎng)1～2 h。

11 抑菌圈測(cè)量的影響

11.1 游標(biāo)卡尺測(cè)量 測(cè)量抑菌圈直徑，眼睛視線應(yīng)與讀數(shù)刻度垂直，游標(biāo)卡尺測(cè)量的尖端與抑菌圈直徑的切點(diǎn)成垂直方向測(cè)量，最好先測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)品和樣品高濃度抑菌圈，再測(cè)量低濃度抑菌圈，以減小游標(biāo)卡尺大范圍移動(dòng)產(chǎn)生的測(cè)量誤差，同時(shí)增加了相同濃度之間的可比性。記錄測(cè)量結(jié)果后進(jìn)行效價(jià)計(jì)算［1］和統(tǒng)計(jì)分析。

11.2 抑菌圈測(cè)定儀測(cè)量 自動(dòng)測(cè)量，電腦測(cè)試、計(jì)算、統(tǒng)計(jì)分析打印結(jié)果即得。注意調(diào)整抑菌圈清析后再進(jìn)行測(cè)量。盡量使用儀器測(cè)量以減小人為因素引起的實(shí)驗(yàn)誤差。

12 討論

利用管碟法測(cè)定抗生素效價(jià)具有準(zhǔn)確、直觀、重復(fù)性好、靈敏度高、便于操作等優(yōu)點(diǎn)。其原理與臨床醫(yī)療基本一致，能夠直接顯示抗生素的抗菌活性。不需要使用太貴重的儀器，成本不高，至今為止絕大多數(shù)抗生素都使用此方法測(cè)定含量。相關(guān)藥廠和地市級(jí)藥品檢驗(yàn)所都能開(kāi)展此項(xiàng)檢驗(yàn)，關(guān)鍵是操作技術(shù)的熟練程度，對(duì)檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性影響很大。筆者認(rèn)為雖然影響因素較多，只要認(rèn)真分析產(chǎn)生的原因，把上述影響因素控制好，消除影響，就能夠使測(cè)量結(jié)果更準(zhǔn)確，滿足藥品含量測(cè)定要求，提高測(cè)量結(jié)果的精密度和準(zhǔn)確性。

［1］中國(guó)獸藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)獸藥典 二○○五年版一部［S］.

［2］中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所.獸藥檢驗(yàn)操作規(guī)程［S］.二○○五.

［3］劉金鳳.抗生素微生物檢定法操作體會(huì)［J］.中國(guó)藥事，2004，18(3):200.

［4］余 萍，傅師一.用微生物法測(cè)定抗生素效價(jià)對(duì)雙碟的技術(shù)要求［J］.中國(guó)獸藥雜志，1994，28(4):34 －35.

［5］金錄勝.管碟法測(cè)定抗生素效價(jià)中抑菌圈圓正及清晰度的控制［J］.中國(guó)獸藥雜志，1993，27(2):36 －37.

［6］李 凡，朱志華，姜鳳麗，等.管碟法測(cè)定生物效價(jià)影響因素的探討及改進(jìn)［J］.中國(guó)獸藥雜志，2008，42(1):45 －48.