黃芪多糖丹參酮對(duì)慢性心衰大鼠MIF表達(dá)的調(diào)控作用

楊志霞，林 謙，馬 利，孫中成，李斐斐，李根茂，葛冬宇

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院心內(nèi)科，北京 100078;2.北京中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，3.北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京 100029)

心力衰竭是心血管疾病的主要死因。心臟的自身神經(jīng)-內(nèi)分泌-能量代謝-免疫網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)可能是心衰時(shí)心室擴(kuò)大和功能異常的重要機(jī)制。CHF時(shí)存在細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的紊亂。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)MIF作為前炎癥細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞(NK)產(chǎn)生 IFN-γ，促進(jìn) TNF-α、IL-6 和粒-單集落刺激因子(GM-CSF)等炎性因子的表達(dá)，通過(guò)抑制心肌收縮力，引起心肌重塑及心肌細(xì)胞凋亡，是導(dǎo)致心衰發(fā)生的一個(gè)新的炎性指標(biāo)［1］?！饵S帝內(nèi)經(jīng)》記載:“正氣存內(nèi)，邪不可干，邪之所湊，其氣必虛。虛久必瘀”。本課題基于氣虛血瘀導(dǎo)致心衰的理論，探索益氣活血中藥的單體提取物—黃芪多糖聯(lián)合丹參酮對(duì)CHF關(guān)鍵性炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-6的上游調(diào)控因子——MIF的干預(yù)效應(yīng)，為臨床治療CHF探索新思路新方法。

1 材料與方法

1.1材料與試劑丹參酮Ⅱ-A(上海第一生物制藥廠，批號(hào)100603);黃芪多糖(廣東惠州東方植物科技有限公司);阿托伐他汀片(德國(guó)輝瑞制藥有限公司，批號(hào)J20070060);PCR引物(大連寶生物工程);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó) Qiagen公司);Rat MIF(RB公司，批號(hào)3R069);TNF-α、IL-6雙抗體夾心ELISA試劑盒(北京四正柏生物科技公司);切片機(jī)(LEITZ WETZLAR GERMANY 1516);顯微鏡(日本Olympus);照相系統(tǒng)(801.Nikon eclipse);IS-ElementsBR2.0圖像分析系統(tǒng)(日本Nikon公司);PCR儀(Bioer XP CycleC);Transiliuminator凝膠成像儀;全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀(506000001，SAFIREⅡ);電熱恒溫培養(yǎng)箱(DH4000A，天津泰斯特);半自動(dòng)洗板機(jī)(Thermo，USA)?！?SD大鼠，體質(zhì)量(200±50)g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2慢性心衰大鼠模型的建立采用冠狀動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)方法［2］:麻醉固定備皮后行氣管插管連小動(dòng)物呼吸機(jī)，行正壓人工呼吸(潮氣量7～8 ml，呼吸頻率80次·min-1)，并描記大鼠正常心電圖。消毒后，沿胸骨左側(cè)第3、4肋間隙開(kāi)胸，用眼科小鑷子輕提并剪開(kāi)心包膜，暴露心臟用無(wú)菌齒鑷輕提左心耳，暴露主動(dòng)脈根部，線繞過(guò)冠狀動(dòng)脈(心上緣)結(jié)扎心肌組織2～3 mm，打2個(gè)死結(jié)，以縫線下心肌色澤變淺、蒼白，同時(shí)心電監(jiān)護(hù)見(jiàn)肢導(dǎo)R波振幅及ST段明顯升高，為結(jié)扎成功?？p合胸壁，皮下注射青霉素80萬(wàn)IU、速尿0.2 ml、利多卡因0.2 ml，待恢復(fù)自主呼吸后撤離呼吸機(jī)。

1.3一般觀察及超聲心動(dòng)圖檢查術(shù)后4 h常規(guī)飼養(yǎng)食水。第2周飼料減半。第3周游泳20 min·(次·d)-1。第4周麻醉后備皮，大鼠取仰臥位。應(yīng)用VEVO7.0超聲顯像儀行超聲多普勒心電圖檢查，將成模大鼠納入實(shí)驗(yàn)組。

1.4實(shí)驗(yàn)分組及給藥方案將成模后大鼠分為模型組、黃芪多糖組(APS，3 g·kg-1·d-1)、丹參酮組(Tan，5 mg·kg-1·d-1)、黃 + 丹組(劑量同上)、阿托伐他汀組(Atorvastatin，10 mg·kg-1·d-1)及假手術(shù)組(Sham)，各給藥組分別給予相應(yīng)體積的藥物，連續(xù)給藥6 wk。

1.5心肌病理形態(tài)學(xué)檢查大鼠活殺后開(kāi)胸剪下心臟，取心尖部心肌，以4℃冷生理鹽水沖洗干凈。用4%多聚甲醛溶液固定。組織固定48 h后常規(guī)脫水、石蠟包埋，6 μm間斷連續(xù)切片、HE染色，光鏡下觀察。

1.6RT-PCR法檢測(cè)心肌MIFmRNA取50～100 mg左心室心肌組織勻漿，TRIzol抽提總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度及純度。4 μl RNA加到12.5 μl反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中，按RT-PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)操作合成 cDNA。1 μl cDNA、0.5 μl引物加入到20 μl擴(kuò)增反應(yīng)體系中，使用PCR擴(kuò)增儀合成DNA。見(jiàn)Tab 1。

Tab 1 PCR reaction program

產(chǎn)物長(zhǎng)度 Rat Actin 380 bp，Rat MIF 406 bp。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色、照相并經(jīng)光密度儀掃描分析，以Actin灰度值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)校正，計(jì)算MIF產(chǎn)物相對(duì)量。

1.7ELISA法檢測(cè)血清MIF、TNF-α及IL-6水平麻醉后大鼠腹主動(dòng)脈取血，干凈促凝管中室溫凝固0.5 h后1 000×g離心15min，收集血清并分裝。按ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作檢測(cè)血清MIF、TNF-α及IL-6水平。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用±s表示，組間差異比較采用one-way ANOVA，同時(shí)應(yīng)用兩兩比較(SNK檢驗(yàn))。

2 結(jié)果

2.1心肌病理形態(tài)學(xué)檢查結(jié)果HE染色光鏡下顯示:假手術(shù)組可見(jiàn)心肌細(xì)胞核橫紋，未見(jiàn)變性、壞死細(xì)胞浸潤(rùn)，心內(nèi)膜及心外膜未見(jiàn)明顯異常(Fig 1A);模型組可見(jiàn)室壁局部不規(guī)則壞死灶，心肌纖維數(shù)量減少，殘余心肌染色變淺，橫紋模糊，部分壞死灶已被膠原纖維所構(gòu)成的瘢痕組織替代，間質(zhì)內(nèi)有較多炎細(xì)胞浸潤(rùn)，在心肌纖維之間有大量結(jié)締組織增生(Fig 1B);藥物組可見(jiàn)壞死灶內(nèi)心肌纖維數(shù)量減少，殘余心肌細(xì)胞比模型組多，橫紋清晰，部分壞死灶已被膠原纖維的瘢痕組織替代，間質(zhì)內(nèi)有少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)(Fig 1C～F)。

2.2RT-PCR法檢測(cè)心肌MIF mRNA表達(dá)情況心肌組織PT-PCR結(jié)果顯示，各治療組心肌MIF mRNA表達(dá)較模型組均明顯降低，RT-PCR電泳產(chǎn)物灰度比值為:假手術(shù)組(0.410±0.105)，阿托伐他汀組(0.532±0.128)，黃 +丹組(0.621±0.123)，黃芪多糖組(0.720±0.205)，丹參酮組(0.795±0.188)，模型組(0.911±0.232)。模型組與假手術(shù)組，黃+丹組與黃芪多糖組、丹參酮組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.05)。見(jiàn)Fig 2，3。

Fig 1 Histopathology of left ventricular in CHF rats(×40)

Fig 2 Expression of myocardial MIFmRNA by RT-PCR detection

Fig 3 Expression of myocardial MIFmRNA by RT-PCR detection

2.3 ELISA 法檢測(cè)血清 MIF、TNF-α、IL-6 表達(dá)的影響結(jié)果顯示，各治療組血清 MIF、TNF-α、IL-6的表達(dá)較模型組均明顯降低，而模型組與假手術(shù)組，黃+丹組與黃芪多糖組、丹參酮組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.05)。見(jiàn)Tab 2。

Tab 2 Expression of serum MIF，TNF-α，IL-6 expression by ELISA detection(xˉ±s，n=5)

3 討論

心力衰竭是大多數(shù)心血管疾病的最終歸宿，也是最主要死因［3］。血清 IL-6、TNF-α的水平與心血管危險(xiǎn)因素患者的生命衰竭有關(guān)［4］，可能通過(guò)下調(diào)肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶，推遲舒張心肌細(xì)胞鈣離子的再吸收和衰減，導(dǎo)致心臟舒張功能不全［5］?；钚匝蹩梢鹧趸瘧?yīng)激誘導(dǎo)MIF分泌，損傷心肌細(xì)胞［6］，推測(cè)MIF可能在急性心肌梗死后心功能不全和心室重構(gòu)中發(fā)揮作用［7］。MIF可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌TNF-α，抑制神經(jīng)體液興奮和心肌收縮力［8］。因此，MIF現(xiàn)已成為多種炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子基因表達(dá)調(diào)控的關(guān)鍵因子。

《本草綱目》記載黃芪為補(bǔ)藥之長(zhǎng)，黃芪多糖是其主要有效活性成分，可通過(guò)抑制人心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞的NF-κB信號(hào)通路，減少炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)［9］。丹參酮Ⅱ-A是丹參的主要有效成分，其抑制血小板黏附、聚集及血栓形成的作用，可能與其抑制肌動(dòng)球蛋白激活的Mg2+-ATP酶活性有關(guān)［10］。他汀類藥物具有多重心血管保護(hù)作用，能有效抑制心肌肥厚及心室重構(gòu)，延緩心衰整個(gè)病程［11］。本實(shí)驗(yàn)采用黃芪多糖聯(lián)合丹參酮對(duì)CHF大鼠細(xì)胞因子的活化進(jìn)行干預(yù)，通過(guò)病理組織學(xué)、RF-PCR法及ELISA法，證實(shí)益氣活血中藥對(duì)大鼠心肌組織MIF活化及血清MIF、TNF-α、IL-6表達(dá)均具有明顯的治療作用，且療效優(yōu)于單一用藥組，其作用機(jī)制可能與抑制基因表達(dá)、細(xì)胞生長(zhǎng)及凋亡，阻斷左室重構(gòu)，從而延緩心衰發(fā)生發(fā)展有關(guān)，中西醫(yī)結(jié)合從心衰-氣虛血瘀證-免疫調(diào)節(jié)-細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的角度，進(jìn)行多層次多靶點(diǎn)的干預(yù)，針對(duì)抗MIF活化的免疫調(diào)節(jié)中藥有望成為CHF治療新靶點(diǎn)。

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