殼寡糖通過(guò)p38MAPK糖基化修飾抑制TNF-α誘導(dǎo)的EA.hy926細(xì)胞IL-6、IL-8的表達(dá)

楊同寧，江躍全，楊火梅，3，李佳佳，楊 竹，3，曹緯國(guó)，朱 冰，唐云喬，于 超

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)研究院，重慶 400016;2.重慶醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院胸心外科，重慶 400010;3.重慶醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，重慶 400010)

血管內(nèi)皮細(xì)胞(vascular endothelial cell，VEC)損傷是動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、糖尿病血管并發(fā)癥等眾多心腦血管疾病的始動(dòng)環(huán)節(jié)或關(guān)鍵因素［1］。因此，發(fā)現(xiàn)和使用能夠抑制IL-6、IL-8等炎癥因子的產(chǎn)生、阻止內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)劑，是預(yù)防心血管疾病發(fā)生的重要策略。

殼寡糖(chitosan oligosaccharides，COS)系由氨基葡萄糖經(jīng)β-1，4糖苷鍵縮合而成，是分子質(zhì)量為2 ku以下的寡聚復(fù)合糖。研究表明，殼寡糖對(duì)小鼠腦缺血/再灌注損傷具有保護(hù)作用［2］，能夠通過(guò)下調(diào)p38及ERK1/2磷酸化，抑制LPS所致HUVECs細(xì)胞IL-6的高表達(dá)［3］及 TNF-α 誘導(dǎo)的 HUVECs細(xì)胞VCAM-1、ICAM-1的表達(dá)增加［4］。但是殼寡糖是通過(guò)何種機(jī)制抑制內(nèi)皮細(xì)胞中炎性誘導(dǎo)所致的細(xì)胞因子高表達(dá)還不十分清楚。近年來(lái)，一些磷酸激酶由于其組成中絲氨酸或蘇氨酸(Ser/Thr)磷酸化位點(diǎn)通常也是O-連接的糖基化(O-GlcNAc)位點(diǎn)，因此，糖基化和磷酸化的競(jìng)爭(zhēng)，對(duì)相應(yīng)激酶產(chǎn)生雙向調(diào)節(jié)，影響其在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用，并形成了所謂“陰-陽(yáng)關(guān)系”學(xué)說(shuō)。在蛋白質(zhì)的O-GlcNAc糖基化過(guò)程中，O-連接 N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶(O-β-N-acetylglucosaminyl transferase，OGT)發(fā)揮著重要作用，也是調(diào)節(jié)絲氨酸或蘇氨酸O-GlcNAc糖基化的關(guān)鍵酶［5］。有研究顯示，葡萄糖胺(Glucosamine，GlcN)可誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞的蛋白質(zhì)O-GlcNAc修飾，抑制NF-κB的磷酸化;降低 TNF-α誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞VCAM-1的表達(dá);葡萄糖胺也可通過(guò)蛋白的OGlcNAc修飾，保護(hù)心臟的缺血/再灌流損傷，而OGT抑制劑alloxan可阻止此過(guò)程［6-8］，說(shuō)明細(xì)胞內(nèi)功能蛋白的糖基化在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)過(guò)程中起到非常重要的作用。

殼寡糖是否可以影響糖基轉(zhuǎn)移酶(OGT)的表達(dá)，調(diào)控信號(hào)通路中部分磷酸激酶，降低其磷酸化水平，從而抑制炎癥因子的表達(dá)，值得深入研究。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)TNF-α誘導(dǎo)EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞促進(jìn)IL-6、IL-8表達(dá)，模擬血管內(nèi)皮炎癥模型，探討殼寡糖保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料RPMI1640培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;生長(zhǎng)因子HAT購(gòu)自Sigma公司;殼寡糖及糖胺由中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所提供;腫瘤壞死因子(TNF-α)購(gòu)自Prospec-Tany Technogene公司;細(xì)胞裂解液(TRIzol)及RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增試劑盒(TaKaRa)購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。IL-6、IL-8 ELISA試劑盒購(gòu)自欣博盛生物有限公司;蛋白裂解液及兔抗β-actin抗體購(gòu)自CST公司;抗-OGT，抗-t-p38 MAPK，抗-Phospho-p38(pp38)等抗體購(gòu)自 Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz，CA，USA)公司。p38 抑制劑(SB203580)購(gòu)自Invitrogen Corporation(Carlsbad，CA，USA)公司。

1.2方法

1.2.1EA.hy926血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng) EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)于含胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基(含105U·L-1青霉素，105U·L-1鏈霉素，30 mg·L-1HAT生長(zhǎng)因子添加物)中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，胰酶消化傳代。

1.2.2RT-PCR檢測(cè)IL-6、IL-8 mRNA的表達(dá) 采用TRIzol法提取總RNA，測(cè)RNA濃度。取1 μg逆轉(zhuǎn)錄，條件:37℃，15 min;85℃，5 s。IL-8(292 bp)引物序列:上游引物5'-ATG ACT TCC AAG CTG GCC GTG GCT-3';下游引物5'-TCT CAG CCC TCTTCA AAA ACT TCT C-3'。擴(kuò)增條件:94℃，30 s;60℃，30 s;72 ℃，30 s;30 循環(huán)。IL-6(497 bp)引物序列:上游引物5'-TGA CAA ACA AAT TCG GTA CAT CC-3';下游引物5'-ATC TGA GGT GCC CAT GCT AC-3'。擴(kuò)增條件:94℃，45 s;54 ℃，45 s;72℃，45 s;30循環(huán)。內(nèi)參GAPDH(230 bp)引物序列:上游引物5'-CTC TCT GCT CCT CCT GTT CGA CAG-3';下游引物5'-GTG GAA TCA TAT TGG AAC ATG T-3'。擴(kuò)增條件:94℃，30 s;54 ℃，30 s;72℃，30 s;30循環(huán)。PCR產(chǎn)物電泳后，通過(guò)凝膠成像儀(GelDoc 2000，Bio-Rad，USA)分析結(jié)果 。

1.2.3ELISA方法檢測(cè)培養(yǎng)液中IL-6、IL-8蛋白的分泌 分組處理細(xì)胞后收集培養(yǎng)液，按照說(shuō)明書(shū)中實(shí)驗(yàn)步驟操作，于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組均設(shè)置3個(gè)重復(fù)試驗(yàn)。

1.2.4Western blot分析 收集細(xì)胞，用CST裂解液裂解細(xì)胞，收集蛋白。測(cè)蛋白濃度。蛋白樣品在水中沸煮10 min。聚丙烯酰胺凝膠電泳，用0.45 μm的PE膜轉(zhuǎn)膜，然后用脫脂奶粉封閉1 h，在4℃，分別與抗t-p38，p-p38，OGT，β-actin等抗體孵育過(guò)夜，用PBST漂洗3次后，與辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的二抗孵育1 h。漂洗后，用 ECL化學(xué)發(fā)光法，在Chem GelDoc成像儀(Bio-Rad，USA)分析結(jié)果。

1.2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 每個(gè)實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，應(yīng)用SPSS 12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果采用±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)分析，多組間比較用方差分析法處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1TNF-α誘導(dǎo)EA.hy926細(xì)胞表達(dá)IL-6、IL-8為了確定TNF-α誘導(dǎo)EA.hy926細(xì)胞產(chǎn)生IL-6、IL-8 mRNA表達(dá)的合適時(shí)間。細(xì)胞經(jīng)不同時(shí)間的TNF-α(40 μg·L-1)處理后，采用RT-PCR的方法檢測(cè)IL-6、IL-8的表達(dá)。與對(duì)照組相比TNF-α處理組IL-6、IL-8的表達(dá)均明顯升高(Fig 1)。其中2 h處理組IL-6、IL-8的表達(dá)量最高，分別是對(duì)照組的8.05倍和6.09倍(P＜0.01)。因此，實(shí)驗(yàn)中除特殊說(shuō)明均采用40 μg·L-1TNF-α處理細(xì)胞2 h作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

Fig 1 TNF-α induced IL-6 and IL-8 mRNA expression in EA

2.2殼寡糖抑制TNF-α誘導(dǎo)的EA.hy926細(xì)胞IL-6、IL-8的表達(dá)細(xì)胞采用不同濃度殼寡糖(50～200 mg·L-1)預(yù)處理24 h，再用40 μg·L-1TNF-α刺激2 h。殼寡糖呈濃度依賴方式明顯降低IL-6、IL-8 mRNA表達(dá)(Fig 2A)。與TNF-α刺激組相比，200 mg·L-1殼寡糖預(yù)處理組的IL-6、IL-8 mRNA表達(dá)量分別下降到1/4、1/7(P＜0.05)。表明在轉(zhuǎn)錄水平上殼寡糖可以抑制TNF-α誘導(dǎo)的EA.hy926細(xì)胞IL-6、IL-8 mRNA的表達(dá)。

在蛋白表達(dá)水平，用ELISA方法檢測(cè)培養(yǎng)液中分泌的IL-6、IL-8蛋白，得到相似結(jié)果(Fig 2B)，與對(duì)照組相比，TNF-α刺激組細(xì)胞分泌的IL-6、IL-8蛋白量明顯上升。而殼寡糖處理組與TNF-α刺激組相比則按濃度依賴方式明顯降低。表明殼寡糖抑制TNF-α誘導(dǎo)EA.hy926細(xì)胞IL-6、IL-8的蛋白表達(dá)與轉(zhuǎn)錄水平結(jié)果一致。

2.3殼寡糖抑制TNF-α誘導(dǎo)的EA.hy926細(xì)胞p38MAPK信號(hào)通路的激活為了驗(yàn)證殼寡糖是否能夠抑制TNF-α誘導(dǎo)的EA.hy926細(xì)胞p38MAPK信號(hào)通路的激活，并與抑制IL-6、IL-8表達(dá)相關(guān)。細(xì)胞經(jīng)200 mg·L-1的殼寡糖預(yù)處理24 h，再用TNF-α刺激30 min。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比(Fig 3)，TNF-α刺激組磷酸化p38蛋白量增加2.0倍(P＜0.05)，而殼寡糖處理組磷酸化p38蛋白水平與TNF-α刺激組比較下降了1/2(P＜0.05)。結(jié)果說(shuō)明殼寡糖對(duì) TNF-α誘導(dǎo)的 EA.hy926細(xì)胞p38MAPK信號(hào)通路的激活有明顯的抑制作用。

Fig 2 Effects of COS on IL-6 and IL-8 mRNA(A)and protein(B)expressions of EA hy926 induced by TNF-α

Fig 3 Effects of COS on p38MAPK phosphorylation of EA hy926 induced by TNF-α

2.4TNF-α誘導(dǎo)EA.hy926細(xì)胞IL-6、IL-8的表達(dá)與p38MAPK通路密切相關(guān)將細(xì)胞用p38MAPK抑制劑SB203580(25 μmol·L-1)預(yù)處理1 h，然后經(jīng) TNF-α 刺激2 h，結(jié)果與 TNF-α 刺激組比較(Fig4)，抑制劑組和200mg·L-1的殼寡糖預(yù)處理組相同，使IL-6、IL-8的表達(dá)恢復(fù)到接近空白對(duì)照組的水平(P＜0.01)。說(shuō)明TNF-α誘導(dǎo)的EA.hy926細(xì)胞IL-6、IL-8 mRNA的表達(dá)與p38MAPK信號(hào)通路激活密切相關(guān)，殼寡糖可能通過(guò)抑制p38磷酸化來(lái)調(diào)節(jié)IL-6、IL-8的表達(dá)。

Fig 4 Effects of p38MAPK inhibtor SB203580 on IL-6 and IL-8 mRNA expression of EA hy926 induced by TNF-α

2.5殼寡糖抑制TNF-α誘導(dǎo)的EA.hy926細(xì)胞OGT的表達(dá)下降殼寡糖可抑制TNF-α誘導(dǎo)的EA.hy926細(xì)胞p38MAPK信號(hào)通路的激活，而蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化和O-磷酸化之間具有共同的修飾位點(diǎn)。為了分析二者在殼寡糖調(diào)控下的關(guān)系，將細(xì)胞用200 mg·L-1的殼寡糖處理24 h后，再用TNF-α刺激30 min，結(jié)果OGT的表達(dá)與對(duì)照組相比，TNF-α刺激組明顯下調(diào)(Fig 5)，降到對(duì)照組的1/3(P＜0.05)，而殼寡糖處理組為 TNF-α組的1.76倍(P＜0.05)。表明殼寡糖具有恢復(fù) TNF-α誘導(dǎo)EA.hy926細(xì)胞OGT表達(dá)下調(diào)的作用。

Fig 5 Effects of COS on OGT expression of EA hy926 induced by TNF-α

2.6葡萄糖胺抑制TNF-α誘導(dǎo)EA.hy926細(xì)胞IL-6、IL-8 mRNA的表達(dá)為了進(jìn)一步驗(yàn)證蛋白OGlcNAc修飾與IL-6、IL-8 mRNA表達(dá)相關(guān)，細(xì)胞采用可以促進(jìn)蛋白O-GlcNAc修飾并降低磷酸化水平的葡萄糖胺［8］處理 4 h，再用 TNF-α 刺激 2 h，結(jié)果不同濃度(1～10 mmol·L-1)葡萄糖胺處理組與TNF-α 刺激組相比(Fig 6)，IL-6、IL-8 mRNA 表達(dá)均明顯降低(P＜0.05)。表明這個(gè)過(guò)程可能與增加激酶O-GlcNAc修飾有關(guān)。說(shuō)明殼寡糖至少部分通過(guò)對(duì)蛋白激酶O-GlcNAc修飾調(diào)控TNF-α誘導(dǎo)的EA.hy926細(xì)胞IL-6、IL-8的表達(dá)。

Fig 6 Effects of Glucosamine on IL-6 and IL-8 mRNA expressions of EA hy926 induced by TNF-α

3 討論

心血管系統(tǒng)疾病是當(dāng)今人類健康最主要的威脅之一。而血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是心腦血管疾病的始動(dòng)環(huán)節(jié)或關(guān)鍵因素。在內(nèi)皮細(xì)胞損傷過(guò)程中，炎癥因子表達(dá)是加重?fù)p傷的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其中IL-6、IL-8在招募免疫細(xì)胞發(fā)揮炎癥反應(yīng)中起著重要作用。因此，如何降低損傷，抑制IL-6、IL-8等炎癥因子的分泌，也是當(dāng)今預(yù)防心血管系統(tǒng)疾病發(fā)生的關(guān)鍵［9-12］。本實(shí)驗(yàn)首次證明了殼寡糖可能通過(guò)p38MAPK糖基化修飾調(diào)控TNF-α誘導(dǎo)的EA.hy926細(xì)胞IL-6、IL-8的表達(dá)。

以往研究表明殼寡糖可通過(guò)調(diào)節(jié)p38及ERK1/2 MAPK通路激酶磷酸化抑制 LPS-誘導(dǎo)HUEVCs細(xì)胞 IL-6的表達(dá)［3］;葛根素可通過(guò)調(diào)節(jié)p38及ERK1/2MAPK通路激酶磷酸化抑制LPS-誘導(dǎo) HUEVCs細(xì)胞 IL-6、IL-8 的表達(dá)［13］，說(shuō)明細(xì)胞中p38蛋白磷酸化水平的升高可以促進(jìn)IL-6、IL-8的表達(dá)。而功能蛋白O-連接糖基化和磷酸化共同的絲氨酸/蘇氨酸位點(diǎn)的修飾之間存在的“陰-陽(yáng)關(guān)系”提示我們，殼寡糖能否通過(guò)調(diào)控p38蛋白磷酸化或糖基化水平影響IL-6、IL-8的表達(dá)?而解決這個(gè)問(wèn)題的關(guān)鍵就是要闡明殼寡糖是否能夠影響催化糖基化反應(yīng)的關(guān)鍵酶-OGT的表達(dá)。我們研究結(jié)果顯示TNF-α誘導(dǎo)EA.hy926細(xì)胞表達(dá)IL-6、IL-8與p38磷酸化蛋白上調(diào)密切相關(guān)，殼寡糖能夠通過(guò)抑制p38磷酸化蛋白上調(diào)而降低IL-6、IL-8的表達(dá)，這個(gè)調(diào)控過(guò)程與糖基轉(zhuǎn)移酶OGT的上調(diào)呈正相關(guān)。表明殼寡糖可能通過(guò)對(duì)p38蛋白磷酸化或糖基化的相互作用完成對(duì)p38MAPK信號(hào)的調(diào)控，從而影響TNF-α誘導(dǎo)細(xì)胞的IL-6、IL-8表達(dá)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證此假設(shè)，實(shí)驗(yàn)中還采用了能夠增加蛋白質(zhì)糖基化修飾作用的葡萄糖胺處理細(xì)胞，因?yàn)橛醒芯勘砻鳎?4］葡萄糖胺可通過(guò)OGT途徑增加蛋白質(zhì)糖基化修飾，抑制內(nèi)皮細(xì)胞LL-37誘導(dǎo)的ERK磷酸化，起到保護(hù)受損細(xì)胞的作用。結(jié)果證明葡萄糖胺可以抑制TNF-α誘導(dǎo)的EA.hy926細(xì)胞IL-6、IL-8的表達(dá)，這可能與葡萄糖胺可通過(guò)OGT途徑增加蛋白質(zhì)O-糖基化修飾有關(guān)。而殼寡糖作為小分子的寡聚復(fù)合糖，抑制炎癥因子表達(dá)的方式可能與葡萄糖胺有相似的機(jī)制。這可能是殼寡糖發(fā)揮抗炎作用的一條重要通路。殼寡糖是通過(guò)直接與膜上受體結(jié)合進(jìn)而調(diào)控OGT的表達(dá)，還是進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)通過(guò)調(diào)控相關(guān)信號(hào)通路而影響糖基化的具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。另外，殼寡糖對(duì)功能蛋白O-GlcNAc糖基化水平及其他信號(hào)傳導(dǎo)通路的影響也有待深入研究。

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