巴戟天糖鏈對缺氧復(fù)氧損傷內(nèi)皮細(xì)胞的血管形成作用研究

王 寧，周 鵬，2，馮國清，劉心玉，張培君，吳 斌，胡香杰，喬 鵬

(1.鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，河南鄭州 450052;2.河南中醫(yī)學(xué)院一附院，河南鄭州 450001)

巴戟天(radix morinda officinalis，RMO)為茜草科植物，肉質(zhì)根入藥，是我國著名的四大南藥之一，具有傳統(tǒng)的補腎壯陽、強筋骨，祛風(fēng)濕等作用。巴戟天糖鏈(morindae officinalis oligosaccharides，MOO)是巴戟天醇提物的主要有效成分，本課題組既往研究表明，MOO具有明顯的減輕缺氧/復(fù)氧或缺血/再灌注對心肌的損傷［1］?？梢源龠M(jìn)雞胚絨毛尿囊血管生成［2］;增加MVD的數(shù)量，而且上調(diào)與血管新生相關(guān)的VEGF、bFGF蛋白的表達(dá)，具有促進(jìn)缺血心肌血管新生的作用［3］。本實驗選擇HUVEC為研究對象，首次從細(xì)胞水平觀察MOO對缺氧損傷內(nèi)皮細(xì)胞遷移及管腔樣結(jié)構(gòu)形成的影響，旨在進(jìn)一步觀察MOO促血管生成效應(yīng)，并為其在缺血心肌保護(hù)及促進(jìn)缺血心臟建立側(cè)枝循環(huán)方面的作用提供更加直觀的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗細(xì)胞 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)鄭州大學(xué)生物系多肽生化實驗室祁元明老師惠贈。

1.1.2主要藥品及試劑 巴戟天糖鏈(Morinda officinalis oligosaccharides)的制備:巴戟天(購自廣東省德慶縣藥材公司，一等品，河南省藥品檢驗所李杰鑒定)生藥15 kg粉碎后，分次用體積分?jǐn)?shù)為0.70的乙醇在90℃水浴中煮60 min，將乙醇提取液旋蒸回收乙醇，得濃縮液。用適量的蒸餾水稀釋后，分別用乙醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，棄去乙醚、乙酸乙酯、正丁醇可溶部分，得到醇提物的水溶部分，用層析柱方法分離收集糖鏈部分，其純度為98.76%。實驗用蒸餾水稀釋配成9.0、3.0、1.0 g·L-13種濃度藥液備用;麝香保心丸，上海和黃藥業(yè)有限公司，取1 g加入無血清RPMI 1640中研磨制成20 ml混懸液，1 500 r·min-1離心去沉淀，再用 0.22 μm 微孔濾膜過濾，4℃保存;Matrigel，BD公司;RPMI 1640培養(yǎng)基，美國Gibco公司產(chǎn)品;胎牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司。

1.1.3主要儀器 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，美國Thermo公司;倒置顯微鏡，日本Nikon公司;超低溫高速離心機D-37520，德國Heraeus公司。

1.2實驗方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) HUVEC細(xì)胞接種到50 ml玻璃培養(yǎng)瓶中，加入含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)瓶細(xì)胞長到80%左右時用胰蛋白酶(含EDTA)消化傳代。加入體積分?jǐn)?shù)0.1的胎牛血清及1×105U·L-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，以1×108·L-1的密度接種到新細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，輕輕置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。選取3～8代生長狀態(tài)良好的細(xì)胞用于模型制備。

1.2.2細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷模型制備及分組 根據(jù)文獻(xiàn)［4］的方法，采用氧清除劑連二亞硫酸鈉造成缺氧，種板培養(yǎng)24 h后，各孔棄去培養(yǎng)基，用無糖Earle's液洗細(xì)胞2次，正常對照組加入RPMI 1640培養(yǎng)基;模型組加入含連二亞硫酸鈉終濃度為1×10-3mol的無糖 Earle's液，造成細(xì)胞缺氧損傷［5］;陽性藥對照組加入麝香保心丸(SBW，2 g·L-1)，MOO各組加入含連二亞硫酸鈉終濃度為1×10-3mol的無糖Earle's液及MOO大(0.45 g·L-1)、中(0.15 g·L-1)、小(0.05 g·L-1)，37 ℃孵育 4 h;取出培養(yǎng)板，吸棄各實驗孔液體，用無糖Earle's液洗細(xì)胞2次，各實驗孔均換含藥的無血清 RPMI 1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)12 h，造成細(xì)胞復(fù)氧損傷。

1.2.3細(xì)胞生長狀況檢測 6孔培養(yǎng)板每孔接種1×105個HUVEC，培養(yǎng)24 h待其貼壁后，每孔改用含10%胎牛血清培養(yǎng)液同步化處理24 h后并按上述方法進(jìn)行處理，收獲細(xì)胞，加入終濃度為100 μg的RNA酶，37℃水浴30 min后，加入終濃度50 μg的PI熒光染料避光染色30 min，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。

1.2.4內(nèi)皮細(xì)胞體外遷移實驗 HUVEC在缺氧4 h復(fù)氧12 h后收獲，按文獻(xiàn)方法［6］24孔板每孔加入600 μl正常培養(yǎng)基，放置小室，向小室中加入細(xì)胞懸液 100 μl(1 ×108·L-1)，模型組加入等量 PBS，陽性藥物組加入SBW，各給藥組加入大、中、小劑量的MOO，每組均設(shè)置3個復(fù)孔，37℃培養(yǎng)4 h。去除濾膜上層細(xì)胞，用體積分?jǐn)?shù)0.95的乙醇固定后胎盤藍(lán)染色。顯微鏡下計數(shù)濾膜下表面的細(xì)胞數(shù)，隨機選取8個視野。

1.2.5內(nèi)皮細(xì)胞體外小管形成實驗 參照文獻(xiàn)［6］的方法。HUVEC在缺氧復(fù)氧處理后收獲，制成2×107·L-1細(xì)胞懸液。96孔板每孔加入50 μl Matrigal，37℃條件下溫育4 h后每孔加入上述細(xì)胞懸液100 μl，模型組加入等量 PBS，陽性對照組加入SBW，MOO各組分別加入大、中、小劑量的MOO，每組均設(shè)置3個復(fù)孔，37℃條件下培養(yǎng)。18 h后觀察各組細(xì)胞管狀排列狀況及管狀結(jié)構(gòu)數(shù)量、完整程度，并隨機選取5個視野，應(yīng)用Image J軟件分析顯微鏡下每個視野總的小管面積數(shù)量，結(jié)果以與模型對照組相比的百分?jǐn)?shù)表示。

1.2.6統(tǒng)計學(xué)處理計量資料數(shù)據(jù)用±s表示，采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 16.0進(jìn)行方差齊性檢驗、單因素方差分析，組間用LSD法進(jìn)行兩兩比較。

2 結(jié)果

2.1缺氧復(fù)氧損傷對HUVEC細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響正常培養(yǎng)的HUVEC細(xì)胞核圓，核膜清晰，呈鋪路石樣單層生長模式;缺氧復(fù)氧模型后，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞部分脫落，間隙變大，單個細(xì)胞體積膨大，胞膜呈粗糙褶皺狀，有拉絲現(xiàn)象;SBW組大部分脫落，MOO各劑量組對HUVEC細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷均顯示出不同程度的保護(hù)作用。

2.2流式細(xì)胞儀檢驗細(xì)胞生長狀況如Tab 1所示，正常組與缺氧復(fù)氧模型組G2+S期的細(xì)胞分別占(26.25±1.44)%和(50.07±4.07)%，兩者差異有顯著性(P＜0.05);MOO大、中劑量G2+S期細(xì)胞為(28.24±2.13)%和(34.23±2.56)%，與模型組差異有顯著性(P＜0.05)。

Tab 1 Effect of MOO on cell cycle in HUVECS injured by hypoxia/reoxygenation

2.3巴戟天對缺氧復(fù)氧損傷條件下的細(xì)胞遷移的影響如Tab 2所示模型組與正常組相比，細(xì)胞遷移數(shù)量明顯減少(P＜0.05);MOO各劑量組可明顯增加缺氧復(fù)氧模型組細(xì)胞的遷移數(shù)目(P＜0.05)。陽性對照藥組未表現(xiàn)出促進(jìn)缺氧復(fù)氧損傷的內(nèi)皮細(xì)胞遷移的作用。

Tab 2 Effect of MOO on migration of cells injured by hypoxia/reoxygenation(xˉ±s)

2.4MOO對缺氧復(fù)氧損傷細(xì)胞小管形成的影響如Tab 3所示，正常組與模型組細(xì)胞形成的管腔結(jié)構(gòu)數(shù)量差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，模型組與給藥組相比差別亦有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，SBW組細(xì)胞狀態(tài)不好，未見有小管形成(Fig 1)。

3 討論

治療性血管新生是指在心衰、心肌缺血、心肌梗死的狀態(tài)下，通過一些方法的刺激包括某些藥物的治療作用增加功能性的冠狀動脈分支或側(cè)支循環(huán)的建立或開放，達(dá)到恢復(fù)缺血心肌血供的目的，它為冠心病患者帶來了一種新的治療策略［7］。內(nèi)皮細(xì)胞對于血管新生有著很重要的作用［8-9］，故本實驗選用HUVEC為研究對象。

Fig 1 Effect of MOO on tube formation of cells injured by hypoxia/reoxygenation

Tab 3 Effect of MOO on tube formation of cells injured by hypoxia/reoxygenation(xˉ±s)

細(xì)胞凋亡是心肌細(xì)胞急性損傷過程中心肌細(xì)胞丟失造成心肌受損的重要原因，抗細(xì)胞凋亡可以對抗心肌的急性缺氧/復(fù)氧損傷［10］。巴戟天能夠?qū)θ毖?復(fù)氧過程中的心肌細(xì)胞的形態(tài)具有保護(hù)作用［11］。本實驗結(jié)果也顯示各劑量組MOO處理后在未增加細(xì)胞G2+S期比例情況下卻能減少細(xì)胞脫落，表明巴戟天糖鏈具有抑制細(xì)胞凋亡和促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖的雙重作用，從而起到保護(hù)缺血心肌的作用。

血管新生是一個復(fù)雜過程，單就內(nèi)皮細(xì)胞而言，主要有遷移、增殖和管腔形成等幾個步驟［12］。缺血缺氧是誘導(dǎo)血管形成的原因之一［13］，而血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和管腔形成是血管新生的重要環(huán)節(jié)［14］，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移和小管形成，可能是促治療性血管生成的機制之一［15］。本實驗結(jié)果顯示，在缺氧復(fù)氧損傷情況下細(xì)胞的遷移卻受到了抑制，遷移的細(xì)胞數(shù)量不足正常條件下的一半，而巴戟天糖鏈能夠在缺氧復(fù)氧損傷條件下促進(jìn)細(xì)胞遷移，使遷移的細(xì)胞數(shù)量維持在一個很高的水平。同時在小管形成實驗中，缺氧復(fù)氧損傷模型組細(xì)胞在18 h后才開始相互連接，24 h未能在基質(zhì)膠表面形成完整的管腔樣結(jié)構(gòu)，而MOO大、中、小劑量組細(xì)胞培養(yǎng)6 h即可見有細(xì)胞間的相互連接形態(tài)，18 h在martrigel表面形成完整的管腔樣結(jié)構(gòu)，并隨著濃度的增加和培養(yǎng)時間的延長，管腔結(jié)構(gòu)增多，促進(jìn)缺氧復(fù)氧損傷條件下的小管形成。這表明MOO促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞血管新生，對MOO既往藥理研究有了進(jìn)一步補充，為缺血心肌保護(hù)及促進(jìn)缺血心臟建立側(cè)枝循環(huán)方面的作用提供了更加直觀的實驗依據(jù)。

本實驗中還存在問題，實驗中設(shè)定的陽性藥物麝香保心丸組(SBW)在本實驗中并沒有表現(xiàn)出來其應(yīng)有的作用，可能是制備過程中或者給藥劑量方面的問題，我們將在下一步的實驗中對其查證或換用其他陽性藥物。

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