鞘內(nèi)注射螺內(nèi)酯對(duì)大鼠神經(jīng)根痛的影響

彭良玉，顧小萍，馬 擎，朱蓓蓓，宋麗華，孫曉鳳，馬正良

(南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院麻醉科，江蘇南京 210008)

神經(jīng)根性腰腿痛以痛覺(jué)過(guò)敏及痛覺(jué)超敏為特征，至今仍是臨床難以解決的棘手問(wèn)題。以往研究提示神經(jīng)損傷后，促炎介質(zhì)，如:IL-1β、TNF-α和IL-6在神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)展和形成過(guò)程中起著重要的作用［1］。核轉(zhuǎn)錄因子(nuclear factor κB，NF-κB)在促炎介質(zhì)的產(chǎn)生及中樞敏化的形成中起著重要的調(diào)控作用［2］。NF-κB是由Rel蛋白家族形成的同二聚體或異二聚體，其中p65/p50異二聚體是其最常見(jiàn)類(lèi)型。螺內(nèi)酯是鹽皮質(zhì)激素受體(mineralocorticoid receptor，MR)拮抗劑，通過(guò)拮抗鹽皮質(zhì)激素受體可以抑制 NF-κB的活化，減少促炎介質(zhì)的產(chǎn)生［3］。已知MR在脊髓背角的第2版層有較高的表達(dá)［4］，提示其在疼痛中可能起著重要的調(diào)節(jié)作用。但對(duì)脊髓水平MR在神經(jīng)病理性疼痛中的作用尚未見(jiàn)相關(guān)的研究報(bào)道。本試驗(yàn)擬通過(guò)鞘內(nèi)注射螺內(nèi)酯觀察其對(duì)注射式慢性背根神經(jīng)節(jié)壓迫模型大鼠疼痛行為和脊髓背角中磷酸化的p65(p-p65)的表達(dá)變化，探討螺內(nèi)酯對(duì)神經(jīng)根痛的作用及其機(jī)制。所選螺內(nèi)酯劑量被認(rèn)為可以完全阻斷MR的作用［5］;

1 材料與方法

1.1動(dòng)物、試劑及儀器SPF級(jí)♂Sprague-Dawley(SD)大鼠，體質(zhì)量280～320 g，分籠飼養(yǎng)，室溫24℃～25℃，光照每日8:00～20:00。嚴(yán)格遵守南京大學(xué)動(dòng)物保護(hù)和使用規(guī)定。螺內(nèi)酯(1 g/瓶，生產(chǎn)批號(hào):S3378，Sigma公司，美國(guó))，von Frey纖毛(Stoelting公司，美國(guó))，ME410C型全自動(dòng)熱輻射刺激儀(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所)。β-actin一抗(生產(chǎn)批號(hào):KGAA001)，p65(phoshpo-Ser536)一抗(生產(chǎn)批號(hào):KG11014)和二抗(羊抗兔，生產(chǎn)批號(hào):KGAA35)均購(gòu)至南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

1.2鞘內(nèi)置管、給藥和分組SD大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(50 mg·kg-1)麻醉后按 Yaksh等［6］的方法自枕骨大孔處行蛛網(wǎng)膜下腔置管，置入微細(xì)導(dǎo)管(PE-10)至腰髓平面(～8.5 cm)，有運(yùn)動(dòng)障礙的動(dòng)物棄去不用。在大鼠鞘內(nèi)置管成功后的d 5，77只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham，n=27)，溶劑對(duì)照組(CCD，n=27)和螺內(nèi)酯組(Spir，n=23)，CCD組和Sham組隨機(jī)挑選12只，Spir組隨機(jī)挑選8只用于行為學(xué)測(cè)試，每組余下大鼠再隨機(jī)平均分配到3個(gè)時(shí)間點(diǎn)(CCD術(shù)后d 4、d 7、d 10)用于蛋白檢測(cè)。螺內(nèi)酯溶于10%酒精中，通過(guò)植入的PE10導(dǎo)管給予。Spir組于CCD術(shù)后d 2～4，每次鞘內(nèi)給予3 μg/10 μl，每天 2 次。給藥后予 10 μl生理鹽水沖洗。Sham組及CCD組則每次給予等10%酒精10 μl，后用 10 μl生理鹽水沖洗。

1.3CCD模型建立大鼠慢性背根神經(jīng)節(jié)壓迫疼痛模型(CCD)采用前期研究描述的方法建立［7］。腹腔注射戊巴比妥鈉(50 mg·kg-1)麻醉后，制模組于大鼠背部正中L4～6部位切開(kāi)皮膚，分離脊柱右側(cè)肌肉，暴露乳狀突與橫突，從L5椎間孔用不銹鋼的22-G頓頭針以與中線(xiàn)呈30°～40°，與水平線(xiàn)呈10°～15°的角度向上緩慢置入約4 mm，見(jiàn)右下肢出現(xiàn)抽搐時(shí)再稍微往后退，然后緩慢注入60 μl SURGIFLOTM。注射時(shí)?？梢钥吹接蚁轮霈F(xiàn)1～2次抽搐。注射完SURGIFLOTM后，用6.0的尼龍縫線(xiàn)逐層縫合肌肉和皮膚。Sham組則重復(fù)上述過(guò)程，但是不注入SURGIFLOTM。上述手術(shù)過(guò)程均在無(wú)菌條件下進(jìn)行，并于術(shù)前2 h及術(shù)后d 1～2，腹腔給予頭孢呋辛鈉4 mg。

1.4行為學(xué)測(cè)試制模前3 d，將SD大鼠置于測(cè)行為學(xué)的試驗(yàn)箱中適應(yīng)環(huán)境，每天1 h。并于術(shù)前1 d測(cè)定基礎(chǔ)值。每次測(cè)量行為前將大鼠置于試驗(yàn)箱中適應(yīng)0.5 h。根據(jù)Tal等［8］報(bào)道的方法進(jìn)行痛覺(jué)超敏(allodynia)測(cè)試。大鼠置于20 cm×20 cm×25 cm的透明有機(jī)玻璃箱內(nèi)，放置于30 cm高的鐵絲網(wǎng)(網(wǎng)格1 cm×1 cm)架子上，大鼠于其中自由活動(dòng)。約30 min待大鼠安靜后以不同折力的von-Frey纖毛刺激大鼠足底(最大值設(shè)為15 g)，持續(xù)6～8 s。大鼠后肢出現(xiàn)迅速畏縮、撤回，認(rèn)為是陽(yáng)性反應(yīng)。將出現(xiàn)3次以上陽(yáng)性反應(yīng)的最小von-Frey纖維強(qiáng)度定為大鼠的機(jī)械刺激回縮閾值。兩次刺激之間間隔約15 s。熱敏采用Hargreaves等［9］所描述的方法進(jìn)行檢測(cè)。將大鼠置于底部為3 cm厚玻璃板的20 cm×20 cm×25 cm的透明有機(jī)玻璃箱內(nèi)，用全自動(dòng)熱輻射刺激儀檢測(cè)。初次使用前，調(diào)節(jié)熱輻射刺激儀焦距和光強(qiáng)度，使術(shù)前大鼠基礎(chǔ)縮腿閾值在12～20 s左右。光透過(guò)玻璃板照射于大鼠后足，當(dāng)后肢出現(xiàn)特征性甩動(dòng)、提足或舔舐時(shí)，切斷光源，記錄時(shí)間。每只大鼠測(cè)試5次，去掉最大和最小的2個(gè)值，取余下的3個(gè)數(shù)值的平均值為評(píng)估熱痛敏的縮腿閾值。兩次刺激間至少間隔5 min。預(yù)先設(shè)定輻射光源自動(dòng)切斷時(shí)間為20 s，避免長(zhǎng)時(shí)間照射造成大鼠灼傷。

1.5蛋白印跡麻醉后采用斷頭術(shù)迅速處死大鼠，取出腰段脊髓。分離出脊髓背角，并將左右分開(kāi)。提取蛋白-80℃凍存。BCA法測(cè)蛋白濃度。按照每4 μl蛋白樣品加入1 μl SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5×)比例混合，煮沸5 min。上樣80 μg至8%SDS-PAGE電泳，分離后將蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移到PVDF上。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入一抗(pp65，1 ∶500稀釋;β-actin 1 ∶500稀釋)，4℃孵育過(guò)夜，TBST漂洗，5 min×3次，加入二抗(HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG，1∶5 000稀釋)，室溫振蕩孵育2 h，TBST漂洗，5 min×3次，ECL化學(xué)發(fā)光液作用1 min，壓片、顯影和定影。結(jié)果采用Adobe Photoshop CS2軟件分析，以目的蛋白除以β-actin內(nèi)參條帶的IOD值作為最終結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以±s表示，采用重復(fù)測(cè)量的方差分析以檢驗(yàn)各組間及各組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)間的差異。當(dāng)差異存在時(shí)，用post hoc Newman-Keuls檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。

2 結(jié)果

2.1鞘內(nèi)注射螺內(nèi)酯明顯改善機(jī)械痛覺(jué)超敏和熱輻射痛覺(jué)過(guò)敏用SURGIFLOTM壓迫大鼠背根神經(jīng)節(jié)后，從術(shù)后d 1～14，CCD組受壓側(cè)縮足機(jī)械痛覺(jué)超敏閾值(PWMT)和熱敏潛伏期(PWTL)明顯降低(P＜0.01)，而Sham組和對(duì)側(cè)都沒(méi)有明顯變化。在CCD術(shù)后d 2～4，每次鞘內(nèi)注射3 μg螺內(nèi)酯，每天2次。在術(shù)后d 4、d 7，與CCD組相比，螺內(nèi)酯明顯提高大鼠受壓側(cè)PWMT(Fig 1A，d 4:11.58±1.38vs7.71±0.82，P＜0.01;d 7，10.89 ±1.46vs7.49 ±1.11，P＜0.01)和 PWTL(Fig 1B，d 4:14.14±1.52vs8.19±1.32，P＜0.01;d 7，13.56±1.63vs8.56±1.56，P＜0.01)在此模型上顯示出鎮(zhèn)痛作用;在d 10、d 14，Spir組PWMT和PWTL與CCD組無(wú)差異，說(shuō)明藥物作用已消失，而對(duì)側(cè)的疼痛行為學(xué)則無(wú)變化。結(jié)果見(jiàn)Fig 1。

2.2鞘內(nèi)注射螺內(nèi)酯可以明顯抑制受壓側(cè)腰段脊髓背角中NF-κB的活化在慢性壓迫背根神經(jīng)節(jié)后，與Sham比，CCD組受壓側(cè)脊髓背角中p-p65明顯升高(Fig 2A、B，P＜0.01)。對(duì)側(cè)則沒(méi)有明顯變化。鞘內(nèi)注射螺內(nèi)酯后，與CCD組相比，p-p65的表達(dá)則明顯降低(Fig 2A、C，P＜0.05)。并且這一作用持續(xù)到術(shù)后d 7，與行為學(xué)相一致。

3 討論

MR在脊髓背角第2版層神經(jīng)元中明顯表達(dá)［4］，提示其可能在調(diào)節(jié)疼痛信號(hào)傳遞中起著重要的作用。已有研究提示［10］MR-NF-κB 信號(hào)通路參與了多個(gè)臟器的病變過(guò)程，抑制其活化可以起到臟器保護(hù)作用。許多前期研究都表明［11-13］，MR在突觸的重塑中發(fā)揮著重要的作用。MR是否參與了脊髓水平突觸的重塑從而調(diào)節(jié)神經(jīng)病理性疼痛還需要進(jìn)一步的研究探討。

Fig 1 Effects of intrathecal administration of spironolactone on pain behaviors

NF-κB是由Rel蛋白家族組成的同二聚體或異二聚體，其在免疫反應(yīng)、炎性疾病和細(xì)胞死亡中都起著重要的作用。由于NF-κB可以調(diào)節(jié)多種炎癥以及疼痛相關(guān)蛋白的表達(dá)，其在疼痛中的作用逐漸被認(rèn)識(shí)。特異性抑制脊髓背角中膠質(zhì)細(xì)胞NF-κB活化，可以明顯緩解坐骨神經(jīng)損傷誘導(dǎo)的異常疼痛和痛覺(jué)過(guò)敏癥狀并抑制IL-6和一氧化氮合酶的上調(diào)［14］;鞘內(nèi)注射N(xiāo)F-κB抑制劑可以緩解外周炎癥誘導(dǎo)的疼痛及藥物誘導(dǎo)的中樞性疼痛［2，15］。前期的研究中也發(fā)現(xiàn)，CCD 術(shù)后，NF-κB 活化標(biāo)志物IκB-α 表達(dá)明顯升高，硬膜外給予醋酸潑尼松龍則可以明顯緩解神經(jīng)病理性疼痛［7］。本研究進(jìn)一步證實(shí):在壓迫背根神經(jīng)節(jié)后，同側(cè)脊髓背角中 NF-κB明顯激活，用螺內(nèi)酯抑制NF-κB的激活則可以明顯緩解疼痛癥狀。IκB-α恢復(fù)正常后，鞘內(nèi)給于醋酸潑尼松龍則參與了疼痛的維持［7，16］。而在外周神經(jīng)結(jié)扎誘導(dǎo)的大鼠神經(jīng)病理性疼痛模型，脊髓背角中NF-κB表達(dá)是明顯下調(diào)的［17］，鞘內(nèi)注射糖皮質(zhì)激素不能緩解疼痛反而明顯加劇疼痛癥狀［18］。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了螺內(nèi)酯通過(guò)抑制MR-NF-κB信號(hào)通路而起到鎮(zhèn)痛的作用。

Fig 2 Intrathecal injection of spironolactone inhibited upregulation of phosphorylated p65(p-p65)following chronic compression of the dorsal root ganglia

但Wang等［18］在其另一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)，鞘內(nèi)注射螺內(nèi)酯對(duì)外周神經(jīng)損傷誘發(fā)的神經(jīng)病理性疼痛沒(méi)有影響。這可能與不同的研究模型有關(guān)。前期的研究也表明，腹腔注射螺內(nèi)酯對(duì)不同的疼痛模型的作用不一致，甚至是相反的［19］。神經(jīng)損傷模型誘發(fā)的神經(jīng)病理性疼痛則因神經(jīng)損傷部位不同而對(duì)藥物處理的反應(yīng)也不相同［20］。

綜上所述，脊髓水平MR在神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中起著重要的作用。MR-NF-κB信號(hào)通路是其誘導(dǎo)中樞敏化的重要的機(jī)制之一。MR抑制劑螺內(nèi)酯可以明顯抑制疼痛行為及脊髓背角中NF-κB的活化。這為我們臨床治療神經(jīng)病理性疼痛提供了新的思路，但其用于臨床還需要進(jìn)一步的研究。

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