細(xì)柱五加葉中抗HMGB1總?cè)苹钚晕镔|(zhì)的閃式提取工藝

劉向前 ，鄭禮勝，翁柳娜，鄒方卉，李麗麗

(1. 中南大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，湖南 長沙，410083；2. 湖南中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，湖南 長沙，410208)

五加科五加屬植物大都具有很強(qiáng)和廣泛的藥食用價(jià)值，如滋補(bǔ)、抗風(fēng)濕、抗應(yīng)激、抗疲勞、抗腫瘤等作用，中、日、韓三國都已把它列入各自國家的藥典中，臨床用于治療風(fēng)濕痹痛、腰膝軟弱等病癥[1-6]。倪娜等[6-7]對細(xì)柱五加葉中的三萜類成分進(jìn)行了系統(tǒng)研究，分離出了多個lupane型三萜成分，并對它們進(jìn)行了抗 HMGB1活性篩選，結(jié)果顯示，五加苷元acankoreanogenin A和五加皂苷acankoreoside A均有較強(qiáng)的抗HMGB1活性，有望成為一種抗HMGB1新藥。二次通用旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)是正交回歸組合設(shè)計(jì)的一種，它克服了二次回歸預(yù)測值的方差強(qiáng)烈地依賴于實(shí)驗(yàn)點(diǎn)在因子空間中的位置這個缺點(diǎn)，可由預(yù)測值直接尋找最優(yōu)區(qū)域；采用回歸旋轉(zhuǎn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方法，使在與實(shí)驗(yàn)中心點(diǎn)距離相等的點(diǎn)上具有相同的方差，消除了回歸系數(shù)間的相關(guān)性，從而使實(shí)驗(yàn)次數(shù)大大縮減，計(jì)算簡便，易于得到多因素的較優(yōu)組合及變化趨勢。由于其具有準(zhǔn)確性高、綜合性好、系統(tǒng)性強(qiáng)、信息量大等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)試驗(yàn)和科學(xué)試驗(yàn)[8-10]。我國有豐富的細(xì)柱五加資源，為新藥開發(fā)提供了充足的資源保障，但目前尚無其葉中三萜成分的提取工藝和定量研究報(bào)道。本文作者采用閃式提取法，通過二次通用旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化其工藝，并確定了UV法測定提取物中總?cè)瞥煞趾康臈l件。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

材料為細(xì)柱五加葉，2008年11月采自湖南，經(jīng)鑒定為細(xì)柱五加(Acanthopanax gracilistylus W. W.Smith)葉，陰干。標(biāo)本存于中南大學(xué)制藥工程系標(biāo)本室。

試劑為五加皂苷、五加苷元對照品，由本研究室自制，經(jīng)1D和2D-NMR等光譜鑒定后，HPLC測定其含量＞99.0%，甲醇、乙醇、NaHCO3均為分析純。

儀器為：JHBE-20A型閃式提取器(北京金鼐科技有限公司生產(chǎn))，752型紫外可見分光光度計(jì)(上海光譜儀器有限公司生產(chǎn))，TG328A型物理天平(湘儀天平儀器廠生產(chǎn))，DZF-6020型真空干燥箱(上海精密儀器實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司生產(chǎn))，202-0型電熱恒溫干燥箱。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 提取方法

取細(xì)柱五加葉8.0 g，剪成小塊(直徑＜5.0 mm)，加提取劑適量，閃式提取[11-12]，抽濾，回收溶劑，濃縮，干燥，得干膏。對水分含量進(jìn)行測定[1]，計(jì)算干膏得率。

采用三因子五水平二次通用旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)[13-14]安排實(shí)驗(yàn)，所選因素及水平見表 1。實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果見表2。

1.2.2 總?cè)瞥煞值臏y定

(1) 波長選擇。取五加皂苷和五加苷元對照品各10 mg，精密稱定，分別置于100 mL容量瓶中，加適量飽和NaHCO3溶液[15]，超聲溶解，定容，搖勻，得皂苷和苷元對照品的飽和 NaHCO3溶液。以飽和NaHCO3溶液為空白樣，在190～400 nm波長下掃描，皂苷和苷元最大吸收波長分別為218和214 nm。但在飽和NaHCO3溶液中皂苷比苷元更易溶解，且溶液較穩(wěn)定，故選擇五加皂苷為測定用的對照品，檢測波長為218 nm。

表1 因素水平表Table 1 Factors and coded levels

(2) 對照品溶液的配制。取五加皂苷對照品 10 mg，精密稱定，置于100 mL容量瓶中，飽和NaHCO3溶液溶解，定容，搖勻，即得五加皂苷對照品溶液，并測得它的紫外光譜，見圖1。

(3) 供試品溶液的配制。取1.2.1項(xiàng)下的樣品干膏0.1 g左右，精密稱定，加適量飽和NaHCO3溶液，超聲溶解，冷卻，定容至100 mL，并測得它的紫外光譜，見圖2。

(4) 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。分別精密移取五加皂苷對照品溶液1，2，3，4，5，6，7 mL于7只10 mL容量瓶中，飽和NaHCO3溶液定容，測定218 nm處吸光度。五加皂苷對照品溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3所示。

從圖3可見：在0.01～0.07 g/L范圍內(nèi)，五加皂苷濃度與吸光度成線性，擬合曲線Y=12.275X+0.042 14，相關(guān)系數(shù)為R=0.999 6。

(5) 精密度實(shí)驗(yàn)。取五加皂苷對照品溶液，稀釋2.5倍，以飽和NaHCO3溶液做空白樣，218 nm下測定其吸光度，重復(fù)5次；相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.67%，表明儀器精密度高。

(6) 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

取表2中16號樣品5份，配制供試品溶液；以飽和NaHCO3溶液做空白樣，在波長為218 nm下分別測定其吸光度，RSD為1.22%，表明該方法可靠。

(7) 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。取表2中16號樣品配制供試品溶液；以飽和NaHCO3溶液做空白樣，在波長為218 nm下每隔1.5 h測量1次吸光度，共5次，RSD為0.74%，表明樣品在6 h內(nèi)穩(wěn)定，滿足含量檢測要求。

表2 三因素二次通用旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Three-factor second order rotation combination experimental design and results

圖1 五加皂苷對照品的紫外光譜Fig.1 UV spectrum of standard acankoreoside A

(8) 加樣回收實(shí)驗(yàn)。取表2中17號樣品0.05 g左右5份，精密稱定，分別加入一定量的五加皂苷標(biāo)準(zhǔn)品，配制供試品溶液；以飽和NaHCO3溶液做空白樣，218 nm下分別測定吸光度，計(jì)算總皂苷含量，并計(jì)算出回收率為98.2%，RSD為1.23%，表明該方法回收率較高。

圖2 樣品中五加皂苷的紫外光譜Fig.2 UV spectrum of acankoreoside A in sample

圖3 五加皂苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Calibration curve of acankoreoside A

(9) 總?cè)瞥煞痔崛÷实臏y定。制備供試品溶液；以飽和NaHCO3溶液做空白樣，測定218 nm下各樣品的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總?cè)瞥煞譂舛龋辉俑鶕?jù)干膏量，計(jì)算出總?cè)瞥煞痔崛÷省?/p>

2 結(jié)果與分析

2.1 回歸模型的建立及顯著性檢驗(yàn)

三因素二次通用旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

以綜合評分Y為因變量，3因素Xi的編碼值為自變量，對實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)(見表2)進(jìn)行多元分析，得回歸方程：

對上述方程及各因素的方差分析見表3。

由表 3可以看出：失擬檢驗(yàn) F1=-0.125 07＜F0.05(5,5)=5.05，差異不顯著，說明未控制因素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果干擾很小，擬合不足被否定；擬合檢驗(yàn) F2=165.301 55＞F0.01(9,10)=4.95，達(dá)到極顯著水平；復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.993 3，校正復(fù)相關(guān)系數(shù)Radj2=0.987 3，均說明該方程與實(shí)際情況擬合良好，正確反映了綜合評分與乙醇濃度、提取時(shí)間和提取劑用量與五加葉質(zhì)量之比的關(guān)系。

各實(shí)驗(yàn)因子的偏回歸系數(shù)的檢驗(yàn)結(jié)果表明：X1，X2，X3，X1X2，X12，X22，X32的偏回歸系數(shù)均達(dá)到極顯著水平，這些因素對綜合評分的影響極顯著，而且不是簡單的線性關(guān)系；交互項(xiàng)X2X3未達(dá)到顯著水平，但由于各系數(shù)間具有相關(guān)性，微弱的交互項(xiàng)原則上不能刪除，因此，方程不能簡化[16]。

2.2 主因子效應(yīng)分析

由于回歸模型本身已經(jīng)過無量綱編碼代換，其偏回歸系數(shù)已經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化，故可直接從其絕對值來判斷各因子對目標(biāo)函數(shù)的相對重要性，即一次項(xiàng)系數(shù)的絕對值可反映3因素對綜合評分的影響程度，由回歸方程可知3因素的影響程度從大到小依次為：乙醇濃度，提取時(shí)間，提取劑用量與五加葉質(zhì)量之比。

表3 試驗(yàn)結(jié)果方差分析表Table 3 Analysis of mean square deviation for experiment data

2.3 單因子效應(yīng)及其邊際效應(yīng)分析

分別將回歸方程中的2個變量固定在零水平，進(jìn)行降維分析，即可得到3個以其中1個因素為決策變量的偏回歸模型：

根據(jù)單因子效應(yīng)方程作圖，得到單因子效應(yīng)曲線(圖 4)。經(jīng)計(jì)算，當(dāng) X1=-1.682，X2=-0.4476，X3=1.682，即乙醇濃度為53%，提取時(shí)間為213 s，提取劑用量與五加葉質(zhì)量之比為46.8時(shí)，各單因素對綜合評分的影響最大，最大值分別為 Y1max=21.465，Y2max=16.476，Y3max=17.058。

圖4 單因子效應(yīng)曲線Fig.4 Single factor utility curves

對單因子效應(yīng)方程求一階偏導(dǎo)數(shù)，得到單因子邊際效應(yīng)方程。單因子邊際效應(yīng)方程反映了綜合評分隨不同因子編碼值的變化速率。單因子效應(yīng)方程為：

根據(jù)單因子邊際效應(yīng)方程可以得到單因子邊際效應(yīng)曲線(圖5)。由圖5可知，3條曲線斜率的絕對值依次為：X1＞X2＞X3，說明乙醇濃度的變化對綜合評分的影響最大，提取時(shí)間次之，提取劑用量與五加葉質(zhì)量之比最小，與主因子效應(yīng)分析結(jié)果一致。

圖5 單因子邊際效應(yīng)曲線Fig.5 Marginal utility curves

2.4 因子的交互效應(yīng)分析

為了觀察2個因素同時(shí)對綜合評分的影響，可以進(jìn)行降維分析。令其中1個因素的水平為0，就可得到另外2個因素對綜合評分影響的二元二次方程：

根據(jù)方程分別繪制響應(yīng)面三維圖和等高線圖，結(jié)果如圖6～11所示。

圖6 乙醇濃度和提取時(shí)間響應(yīng)面圖Fig.6 Response of surface of alcohol level and extraction time

圖7 乙醇濃度和提取時(shí)間等高線圖Fig.7 Contour line of alcohol level and extraction time

圖8 乙醇濃度和提取劑用量與五加葉質(zhì)量之比響應(yīng)面圖Fig.8 Response of surface of alcohol level and extracting agent concentration

圖9 乙醇濃度和提取劑用量與五加葉質(zhì)量之比等高線圖Fig.9 Contour line of alcohol level and extracting agent concentration

圖6 和圖7反映了乙醇濃度X1和提取時(shí)間X2之間的交互作用。當(dāng) X2處于編碼值范圍內(nèi)時(shí)，Y隨 X1的減小而顯著增大；當(dāng)X1處于低編碼值范圍內(nèi)時(shí)，Y隨X2的減小也呈增大趨勢；因此，乙醇濃度和提取時(shí)間兩者具有顯著協(xié)同作用。

圖10 提取時(shí)間和提取劑用量與五加葉質(zhì)量之比響應(yīng)面圖Fig.10 Response of surface of extraction time and extracting agent concentration

圖11 提取時(shí)間和提取劑用量與五加葉質(zhì)量之比等高線圖Fig.11 Contour line of extraction time and extracting agent concentration

圖8 和圖9反映了乙醇濃度X1和提取劑用量與五加葉質(zhì)量之比 X3的交互作用。當(dāng)X3處于編碼值范圍內(nèi)時(shí)，Y隨X1的減小而顯著增大；當(dāng)X1處于較低編碼值范圍內(nèi)時(shí)，Y隨X3的減小只有微弱變化；因此，乙醇濃度和提取劑用量與五加葉質(zhì)量之比兩者之間的協(xié)同作用不明顯。

圖10和圖11反映了提取時(shí)間X2和提取劑用量與五加葉質(zhì)量之比 X3的交互作用。由于交互項(xiàng) X2X3未達(dá)到顯著水平，故不進(jìn)行具體討論。

2.5 數(shù)學(xué)模型尋優(yōu)

利用回歸方程，在試驗(yàn)約束區(qū)域內(nèi)(-1.682≤X1≤1.682，-1.682≤X2≤1.682，-1.682≤X3≤1.682)，取步長為0.116，通過MATLAB編程，進(jìn)行計(jì)算機(jī)模擬仿真選優(yōu)(實(shí)驗(yàn)次數(shù)N=30)，得到27 000套方案的模擬結(jié)果，從中篩選出綜合評分≥22.000的組合方案326套，占1.21%，Xi的頻率分布解析見表4。

由表4可以看出，當(dāng)X1為-1.682，X2=-1.278 3～-0.927 1，X3=-0.558 4～0.408 2時(shí)，綜合評分有95%的可能性高于22.000。此時(shí)，相應(yīng)的解碼值為：乙醇濃度為53%，提取時(shí)間為163.3～184.4 s，提取劑用量與五加葉質(zhì)量之比為24.4～34.1。

表4 綜合評分≥22.000的優(yōu)化提取方案中Xi取值頻率分布Table 4 Probability distribution of Xi in combined application

2.6 最佳工藝參數(shù)的確定與回歸模型的驗(yàn)證

考慮到可操作性及貼近實(shí)際工業(yè)化生產(chǎn)，將最優(yōu)提取條件定為：乙醇濃度53%，提取時(shí)間175 s，提取劑用量與五加葉質(zhì)量之比為30 mL/g。

為驗(yàn)證上述優(yōu)選出來的工藝，按數(shù)據(jù)分析得出的最優(yōu)提取條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表5所示。

表5 最佳工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 5 Confirmatory experiment result of the best technique

由表5可知：該工藝的綜合評分為22.292，RSD=0.77%。與表 2實(shí)驗(yàn)結(jié)果相比，該工藝的綜合評分高于優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中的任何一組，且該工藝穩(wěn)定，重現(xiàn)性好，操作簡單、省時(shí)。

3 討論

閃式提取法是中藥提取領(lǐng)域的一項(xiàng)新技術(shù)，其原理是在適當(dāng)溶劑存在下，利用高速機(jī)械剪切力和攪拌力，迅速破壞植物細(xì)胞組織，使組織細(xì)胞內(nèi)部的化學(xué)成分(或有效成分)與溶劑充分接觸，使有效成分快速溶解轉(zhuǎn)移，在很短時(shí)間內(nèi)達(dá)到內(nèi)外溶解平衡，然后過濾即可。其所用時(shí)間僅為常規(guī)回流提取的數(shù)十至數(shù)百分之一，而且避免了不耐熱成分的破壞，且收率高，操作簡便，節(jié)約溶劑和能源[11-12]。

在溶劑和波長的選擇中，分別考察了甲醇法和NaHCO3飽和溶液法[15]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：甲醇法波長掃描后得到的是倒峰，沒有出現(xiàn)特定吸收峰，故不能選擇甲醇作為測定細(xì)柱五加葉中三萜類物質(zhì)的溶劑；在NaHCO3飽和溶液中，五加皂苷的最大吸收峰(218 nm)與其苷元的(214 nm)非常接近，不能同時(shí)或分別測定它們的含量，只能測定三萜成分的總含量。研究表明，葉中皂苷含量遠(yuǎn)大于苷元含量[6]，皂苷在飽和NaHCO3溶液中比苷元易溶，且溶液較穩(wěn)定，故選擇五加皂苷為測定用的對照品，檢測波長為218 nm。

4 結(jié)論

(1) 采用閃式提取法提取細(xì)柱五加葉中三萜成分，并用二次通用旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化其提取工藝，結(jié)果得到最佳工藝如下：乙醇濃度為53%，提取劑用量與五加葉質(zhì)量之比為30 mL/g，提取時(shí)間為175 s。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：該工藝穩(wěn)定，重現(xiàn)性好，操作簡單、省時(shí)。

(2) 確定了 UV法測定細(xì)柱五加葉及其提取物中總?cè)瞥煞值姆椒橐晕寮釉碥諡閷φ掌?，飽和NaHCO3溶液為溶劑，218 nm為最適波長。該方法穩(wěn)定可靠，易于操作，可用于細(xì)柱五加葉、五加皮以及其同屬植物中總?cè)瞥煞趾康臏y定。

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