采用ICP-AES法測(cè)定香煙煙氣成分中金屬離子在動(dòng)物體內(nèi)的蓄積

鐘狂飆，桂明，朱立勇 , 李維，管茶香，郭方遒

(1. 中南大學(xué) 湘雅三醫(yī)院泌尿外科，湖南 長(zhǎng)沙，410083；2. 中南大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙，410083)

全世界每年有300萬(wàn)人死于與吸煙有關(guān)的疾病，煙草給人類健康帶來(lái)嚴(yán)重威脅。俄羅斯科學(xué)院X線放射學(xué)與毒理學(xué)科研所研究人員用原子吸附分析法對(duì)志愿者血液中的重金屬Pb，Cd和Mn的含量進(jìn)行了測(cè)定，發(fā)現(xiàn)吸煙加劇了體內(nèi) Cd等重金屬的積累，這些重金屬會(huì)破壞和影響細(xì)胞內(nèi)受損 DNA的修正與恢復(fù)[1]。香煙煙葉由于受其生長(zhǎng)環(huán)境的污染以及煙葉自身種類特點(diǎn)的影響，都會(huì)含有一定量的重金屬等有害元素，如Pb，Cr，Cd和Hg等[2]。煙絲比其他植物更能從土壤中聚積Cd，煙葉中Cd的含量要比允許的含量高許多倍[3-4]。吸煙對(duì)血清中 Cu，Zn，F(xiàn)e，Pb和Cd等金屬元素有明顯的影響。據(jù)報(bào)道，吸煙者Pb和Cd含量比不吸煙者含量明顯增高，且與吸煙量呈正相關(guān)[5]，金屬離子尤其是Ni和Cd在腎臟組織中具有蓄積特點(diǎn)[6-9]。目前，人們對(duì)吸煙對(duì)動(dòng)物體內(nèi)組織和血液中金屬元素的蓄積效應(yīng)研究較少。在此，本文作者以大白兔為研究對(duì)象，測(cè)定其腎臟組織在吸煙前后多種有害金屬元素的蓄積作用。電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法(ICP-AES)與經(jīng)典的火焰法、電弧法、火花光譜分析法及原子吸收法相比，其線性動(dòng)態(tài)范圍寬 4～5個(gè)數(shù)量級(jí)，且具有靈敏度高、穩(wěn)定性好、基體效應(yīng)小、分析速度快、可同時(shí)分析多元素等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于生物樣中微量元素的測(cè)定[10-13]，為此，采用ICP-AES法測(cè)定了大白兔在吸煙前后血液和組織中多種金屬元素的含量，以便為進(jìn)一步研究吸煙對(duì)動(dòng)物腎臟損傷的生物學(xué)研究作好前期工作。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

儀器為iCAP 6500型電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜儀(美國(guó)熱電公司)。

試劑為乙醇、硝酸、高氯酸、氫氟酸和鹽酸，均為優(yōu)級(jí)純。實(shí)驗(yàn)用水為二次去離子水。

1.2 儀器工作條件

高頻頻率為27.68 MHz，發(fā)射功率為1 150 W，冷卻氣流量為1.5 L/min，輔助氣流量為0.5 L/min，霧化室壓力為179 kPa，溶液提升量為1.85 mL/min。觀測(cè)高度為 15 mm，積分時(shí)間為 15 s，氬氣純度大于99.99%。對(duì)于分析線(波長(zhǎng))：Hg為194.20 nm，Se為361.38 nm，Sn為189.90 nm，Pb為220.35 nm，Cd為228.80 nm，Ni為231.60 nm，Cr為205.55 nm。

1.3 工作曲線及檢出限

Hg，Cr，Ni，As，Se，Cd和Pb的標(biāo)準(zhǔn)溶液均購(gòu)自國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心，標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液按需要由體積分?jǐn)?shù) 5%的 HNO3介質(zhì)逐級(jí)稀釋而成，分別配制成0，0.01. 0.05，0.10，0.20，0.50，1.00，1.50，2.00 和10.00 mg/L標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量濃度，以凈光強(qiáng)為縱坐標(biāo)，以元素的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制校準(zhǔn)曲線。對(duì)試劑空白進(jìn)行 10次測(cè)定，儀器自動(dòng)計(jì)算檢出限。

1.4 動(dòng)物吸煙模型

采用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物被動(dòng)吸煙方式(圖1)，最大限度地模擬人類吸煙。由于煙氣中含有的多種有害物質(zhì)在側(cè)流煙霧中的含量還要高于主流煙霧含量[14]，故被動(dòng)吸煙者完全可能造成與主動(dòng)吸煙者同樣的危害。采用真空泵抽吸裝置模擬人類吸煙時(shí)肺內(nèi)負(fù)壓狀態(tài)，將香煙煙氣通過(guò)真空泵向動(dòng)物吸煙箱內(nèi)脈沖泵入；同時(shí)，氧氣經(jīng)流量計(jì)，與煙氣融合進(jìn)入動(dòng)物吸煙間。吸煙間內(nèi)置氧氣濃度檢測(cè)儀，通過(guò)檢測(cè)吸煙間內(nèi)氧氣體積分?jǐn)?shù)，控制其為20%～21%，間接估計(jì)其中煙氣質(zhì)量濃度。香煙煙氣經(jīng)過(guò)管道長(zhǎng)度盡量縮短，以減少煙氣中各成分貼壁黏附損耗。并定時(shí)(1周/次)清洗煙氣管道及動(dòng)物吸煙間，減少管道、室壁煙氣尤其焦油殘余量存留。

圖1 模擬動(dòng)物吸煙裝置圖Fig.1 Simulated animal smoking equipment

1.5 樣品制備

采用普通級(jí)實(shí)驗(yàn)用大白兔(購(gòu)自湖南寧鄉(xiāng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)廠)。實(shí)驗(yàn)前，均在實(shí)驗(yàn)室圈養(yǎng)20 d，再開(kāi)始動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。兔子均為成年大白兔，體質(zhì)量達(dá)1.75 kg以上。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為4組：空白對(duì)照組(E組)、蓋白沙煙組(H組)、白沙精品二代煙(J組)和NISE煙組(N組)。每組動(dòng)物又分吸煙2周組、4周組、8周組、12周組和16周組，每組6只，每組給予相同的基礎(chǔ)飼料自由采食，吸煙組按給定時(shí)間采用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物被動(dòng)吸煙方式吸煙，到給定吸煙時(shí)間后通過(guò)斷頸椎處死取腎臟樣品。

腎臟組織置于經(jīng)鹽酸處理的潔凈稱量瓶?jī)?nèi)，于80 ℃烘干至恒質(zhì)量，烘干組織后將其粉碎。采用微波加熱高壓聚四氟乙烯罐酸濕消化法消化組織樣品，稱取20.0 mg恒質(zhì)量后樣品，置于容樣杯中，然后加入5 mL 70% HNO3和1 mL 30% H2O2，采用2檔消化7 min，消化完全后定容至10 mL。

2 結(jié)果與討論

2.1 分析譜線的選擇

由于電感耦合等離子體光源激發(fā)能量很高，有大量發(fā)射譜線，幾乎每種元素的分析線都受到不同程度的干擾。選擇分析線一方面要保證其有足夠的靈敏度，另一方面要盡量避免其他譜線重疊干擾。本試驗(yàn)中對(duì)每個(gè)元素選取2～3條譜線測(cè)定，綜合元素的檢出限、共存元素干擾、背景干擾和該元素的線性范圍，經(jīng)實(shí)驗(yàn)確定的各元素分析波長(zhǎng)分別為：Hg 194.20 nm，Se 361.38 nm，Sn 189.9 nm，Pb 220.35 nm，Cd 228.80 nm，Ni 231.60 nm，Cr 205.55 nm。

2.2 方法的檢出限、回收率和精密度

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制，經(jīng)試驗(yàn)測(cè)得各元素標(biāo)準(zhǔn)曲線在 0～2.0 mg/L之間呈線性良好，相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.999。按樣品處理方法對(duì)10份空白溶液進(jìn)行測(cè)定，取標(biāo)準(zhǔn)偏差的3倍為各元素的檢出限，Hg，Se，Sn，Pb，Cd，Ni和Cr 的檢出限分別為：Hg 5.9 μg/L，Se 22 μg/L，Sn 22 μg/L，Pb 22 μg/L，Cd 2.7 μg/L，Ni 3.7 μg/L，Cr 6.1 μg/L。按實(shí)驗(yàn)方法從組織樣品溶液中選取第12周樣品7份進(jìn)行加標(biāo)回收率測(cè)定，用ICP-A ES同時(shí)測(cè)定以上7種元素的含量，計(jì)算加標(biāo)回收率見(jiàn)表1。各元素回收率為95.0%～ 104.2%，準(zhǔn)確度較好，表明方法可用于實(shí)際樣品分析。

2.3 金屬元素在腎臟中的蓄積效應(yīng)

金屬離子尤其是Ni和Cd在動(dòng)物體內(nèi)具有蓄積特點(diǎn)[15]。已有研究表明，重金屬離子對(duì)腎臟有損傷作用。本文中對(duì)大白兔經(jīng)被動(dòng)吸煙后2周、4周、8周、12周和16周后采用斷頸法處死，收集腎臟標(biāo)本，取得其腎臟組織，測(cè)得各金屬離子在其中的質(zhì)量濃度，結(jié)果如表2所示。

從表2可以看出：大白兔在被動(dòng)吸食3種不同香煙后，腎臟中Hg，Se，Sn，Pb，Cd，Ni和Cr的質(zhì)量濃度隨吸食時(shí)間的增加而增加；吸食到12周以后金屬離子質(zhì)量濃度變化趨于穩(wěn)定，其中以Hg，Se和Pb的質(zhì)量濃度變化更為明顯，Sn和Ni的質(zhì)量濃度變化很小，幾乎沒(méi)有蓄積效應(yīng)。如圖2所示為吸食3種不同香煙NISE、精白沙、盒白沙12周后，Hg，Se，Pb，Cd和Cr這5種金屬離子在大白兔腎臟中的質(zhì)量濃度分布。結(jié)果表明：吸食此3種香煙后，金屬離子質(zhì)量濃度都有明顯增加，NISE煙組的質(zhì)量濃度表現(xiàn)最顯著，NISE煙組中Hg，Se，Pb，Cd和Cr的質(zhì)量濃度分別達(dá)到1.022，1.822，0.750，0.124和0.152 mg/L，為正常組的 6.6，9.1，13.9，5.7和 4.8倍；Ni和 Sn的質(zhì)量濃度變化較小，可能和煙葉中該2種組分質(zhì)量濃度較小有關(guān)。金屬離子在腎臟組織中具有蓄積作用，Hg，Se，Pb，Cd和Cr這5種金屬離子在香煙組與對(duì)照組相比明顯提高，表明其在腎臟中蓄積，可能導(dǎo)致腎臟炎癥，纖維組織增生的原因有待進(jìn)一步研究。

表1 腎臟樣品中金屬離子的回收率(n=7)Table 1 Recoveries of metal ion in kidney

表2 腎組織中金屬質(zhì)量濃度Table 2 Contents of metal ions in kidney of rabbit mg/L

圖2 吸食不同香煙后金屬離子在大白兔腎臟中的蓄積作用Fig.2 Accumulation effect of metal ions in kidney of rabbit after smoking different kinds of cigarettes

3 結(jié)論

(1) 建立了電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法測(cè)定動(dòng)物組織中痕量和微量重金屬離子含量的方法。本方法準(zhǔn)確度高，精密度好，適合于動(dòng)物腎臟樣品中微量重金屬離子質(zhì)量濃度的同時(shí)測(cè)定。

(2) 利用動(dòng)物被動(dòng)吸煙模型，考察大白兔在吸食3種不同香煙后不同時(shí)期后腎臟中7種重金屬離子的質(zhì)量濃度變化，發(fā)現(xiàn)Hg，Se，Pb，Cd和Cr離子在其腎臟中具有明顯的蓄積作用，經(jīng)12周后，以上幾種元素在體內(nèi)質(zhì)量濃度較正常組分別高 5.6，8.1，12.9，4.7和3.8倍。

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