FADD在人肺腺癌細(xì)胞A549誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞凋亡中的作用

王紅梅 張國(guó)強(qiáng) 閔家新

第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院胸外科，重慶 400037

FADD在人肺腺癌細(xì)胞A549誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞凋亡中的作用

王紅梅 張國(guó)強(qiáng) 閔家新

第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院胸外科，重慶 400037

背景與目的：細(xì)胞凋亡是肺癌免疫逃逸的機(jī)制之一。Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白(Fas associated death domain protein，F(xiàn)ADD)在細(xì)胞凋亡過(guò)程中起著重要作用。本研究旨在探討FADD在人肺腺癌細(xì)胞A549誘導(dǎo)人T淋巴細(xì)胞凋亡過(guò)程中的作用。方法：用人肺腺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞誘導(dǎo)人淋巴瘤T細(xì)胞株Jurkat細(xì)胞凋亡，分別于0、2、4和6 h后用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Jurkat細(xì)胞的凋亡率；RT-PCR及Western blot檢測(cè)Jurkat細(xì)胞中FADD的mRNA及蛋白表達(dá)情況。結(jié)果：人肺腺癌細(xì)胞A549誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡呈時(shí)間依賴性，各實(shí)驗(yàn)組中Jurkat細(xì)胞表達(dá)FADD蛋白及mRNA水平較對(duì)照組顯著升高。結(jié)論：肺癌細(xì)胞可能通過(guò)影響T淋巴細(xì)胞FADD表達(dá)從而反擊機(jī)體免疫系統(tǒng)，達(dá)到自身免疫逃逸的目的。

肺癌； Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白； 凋亡

肺癌是常見(jiàn)惡性腫瘤之一，目前主要的治療方法為手術(shù)、化療及放療，但仍然存在術(shù)后復(fù)發(fā)率高，生存期短的問(wèn)題［1］，因此肺癌的免疫治療已經(jīng)成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。目前對(duì)肺癌發(fā)病機(jī)制的研究表明，在肺癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中，肺癌細(xì)胞不僅可以通過(guò)“免疫逃逸”機(jī)制逃避宿主免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和攻擊，減少自身凋亡；還可以通過(guò)“Fas反擊”機(jī)制造成宿主免疫能力降低［2］。由于Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白(Fas associated death domain protein，F(xiàn)ADD)是Fas凋亡信號(hào)途徑中的必需蛋白［3］，本研究利用人肺腺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞誘導(dǎo)人淋巴瘤T細(xì)胞株Jurkat細(xì)胞凋亡，形成“Fas反擊”的體外細(xì)胞培養(yǎng)模型，檢測(cè)不同培養(yǎng)時(shí)間后Jurkat細(xì)胞凋亡及FADD表達(dá)的變化情況，為進(jìn)一步明確FADD在肺癌免疫逃逸中的作用機(jī)制、尋找肺癌免疫治療新方法提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

人肺癌細(xì)胞株A549由第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院呼吸研究所提供，人淋巴瘤T細(xì)胞株Jurkat(ATCC TIB-152)由上海麥莎生物科技有限公司代購(gòu)；澳大利亞優(yōu)質(zhì)胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)于Hyclone公司。Annexin V(FITC)/PI凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于杭州隆基生物工程研究所。蛋白提取液購(gòu)于Pierce公司，羊抗人FADD單克隆抗體、鼠抗人β-actin單克隆抗體購(gòu)于Santa Cruz公司，考馬斯亮藍(lán)試劑盒購(gòu)于南京建成生物科技有限公司?？俁NA提取試劑盒及兩步法RT-PCR試劑盒購(gòu)于GENEAID公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

從液氮中取出凍存的A549細(xì)胞及Jurkat細(xì)胞，37 ℃迅速解凍，分別以含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基進(jìn)行復(fù)蘇、培養(yǎng)，細(xì)胞傳至第4代左右，臺(tái)盼藍(lán)染色排斥法檢測(cè)2種細(xì)胞活性均在95%以上開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。將A549細(xì)胞以5×105mL-1密度接種至培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿至85%左右，計(jì)數(shù)約1×106mL-1，吸去培養(yǎng)液；用含10%胎牛血清的RPMI 1640新鮮培養(yǎng)基將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期約1×106個(gè)Jurkat細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，加入A549細(xì)胞培養(yǎng)瓶中分別共培養(yǎng)0、2、4和6 h后分組收集Jurkat細(xì)胞。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組Jurkat細(xì)胞凋亡率

用離心管分別收集各組中Jurkat細(xì)胞，1 500 r/min、離心半徑5 cm，離心10 min，棄上清液，用PBS洗滌離心1次，棄上清液，向離心管中加入300 μL Banding buffer及5 μL AnnexinV-FITC，混勻，室溫避光溫育15 min，再加入5 μL PI，室溫避光溫育5 min，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，同時(shí)以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作為對(duì)照。

1.2.3 RT-PCR檢測(cè)各組Jurkat細(xì)胞中FADD的mRNA表達(dá)

將收集的Jurkat細(xì)胞用PBS離心洗滌后，按試劑盒說(shuō)明書(shū)，提取細(xì)胞總RNA，采用兩步法進(jìn)行R T-P C R操作。所用引物序列由華大基因上海鼎安生物科技有限公司設(shè)計(jì)，F(xiàn) A D D上游引物序列為：5’-CCGCCATCCTTCACCAGA-3’，下游引物序列為：5’-TACGAGATCCCGCTGCCT-3’，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為415 bp；GAPDH上游引物序列為：5’-CATGGGTGTGAACCATGAGAAGTA T-3’，下游引物序列為：5’-GACTGTGGTCAT GAGTCCTTCCA -3’，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為139 bp。取PCR產(chǎn)物5 μL，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳成像。

1.2.4 Western blot檢測(cè)各組Jurkat細(xì)胞中FADD蛋白表達(dá)

把已收集的Jurkat細(xì)胞用PBS洗滌，于1 500 r/min、離心半徑5 cm，離心10 min后，加入含蛋白酶抑制劑的蛋白提取液，提取細(xì)胞總蛋白，用考馬斯亮藍(lán)G250試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，畫(huà)蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線并調(diào)整濃度基本一致后100 ℃煮沸變性。取適量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，半干法轉(zhuǎn)膜，封閉，按1∶1 000分別溫育羊抗人FADD單克隆抗體及鼠抗人β-actin單克隆抗體，4 ℃過(guò)夜后洗膜，按1∶1 000分別溫育二抗，洗膜后用化學(xué)發(fā)光底物顯影照相。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果用表示，利用SPSS 13.0軟件對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，組間多重比較采用Tukey法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Jurkat細(xì)胞凋亡率檢測(cè)

從檢測(cè)結(jié)果可以看出，在A549細(xì)胞對(duì)Jurkat細(xì)胞分別作用2、4和6 h后，Jurkat細(xì)胞凋亡率分別為(8.23±0.17)%、(9.11±0.21)%和(11.11±0.32)%，呈明顯增高趨勢(shì)；空白對(duì)照組凋亡率為(1.53±0.10)%，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；2 h組與6 h組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，其余組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1)。

2.2 FADD表達(dá)的檢測(cè)

各組中Jurkat細(xì)胞均表達(dá)FADD，所有實(shí)驗(yàn)組中FADD蛋白及mRNA的表達(dá)均顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)，隨A549作用時(shí)間的延長(zhǎng)，各實(shí)驗(yàn)組中Jurkat細(xì)胞在mRNA水平的FADD表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(圖2A、B)，各實(shí)驗(yàn)組中FADD蛋白水平的表達(dá)也呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì)，實(shí)驗(yàn)組顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，但組間差異并未達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)(圖3A、B)。

3 討 論

FADD又名MORT1、FAS相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白，存在于細(xì)胞胞質(zhì)中，是細(xì)胞凋亡信號(hào)通路中的胞質(zhì)死亡信號(hào)銜接蛋白，也是Fas/FasL介導(dǎo)的凋亡途徑中的必需分子［4-6］。人FADD蛋白組織分布無(wú)特異性，存在于許多成年個(gè)體和胚胎的多種組織中。當(dāng)Fas與FasL結(jié)合導(dǎo)致Fas胞內(nèi)的死亡域形成三聚體而活化，并引起與之結(jié)合的FADD構(gòu)象改變，使Caspase-8活化并激發(fā)下游的Caspase-3、6等級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘發(fā)細(xì)胞凋亡［7］。

研究表明，F(xiàn)ADD的表達(dá)在惡性腫瘤組織中低于腫瘤周邊正常組織。通過(guò)上調(diào)腫瘤組織中FADD的表達(dá)，可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的發(fā)生。但對(duì)于在腫瘤細(xì)胞免疫逃逸過(guò)程中，機(jī)體淋巴細(xì)胞表達(dá)FADD的變化情況研究很少。向青等［8］和王紅梅等［9］利用不同種類(lèi)的人肺癌細(xì)胞株細(xì)胞誘導(dǎo)人淋巴瘤T細(xì)胞株Jurkat細(xì)胞凋亡，證實(shí)了肺癌細(xì)胞可以通過(guò)“Fas反擊”攻擊機(jī)體免疫系統(tǒng)，但對(duì)于這一過(guò)程中T淋巴細(xì)胞表達(dá)FADD的變化情況報(bào)道甚少。

本研究結(jié)果表明，在肺癌細(xì)胞A549介導(dǎo)的Jurkat細(xì)胞凋亡發(fā)生過(guò)程中，隨著凋亡的發(fā)生，Jurkat細(xì)胞中FADD蛋白及mRNA表達(dá)水平均明顯升高，由此可以推論，在肺癌發(fā)生、發(fā)展的進(jìn)程中，肺癌細(xì)胞可能通過(guò)促進(jìn)機(jī)體T淋巴細(xì)胞高表達(dá)FADD，導(dǎo)致部分T淋巴細(xì)胞的凋亡，從而逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)的攻擊。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，Jurkat細(xì)胞凋亡率隨著A549作用時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，呈時(shí)間依賴性；這也可以解釋肺癌患者晚期出現(xiàn)抵抗力下降、手術(shù)效果差等情況［10］。

Peggs等［11］的研究表明，化療藥物可以上調(diào)多種腫瘤細(xì)胞包括人淋巴瘤T細(xì)胞株Jurkat的FADD表達(dá)。結(jié)合本研究還可以推測(cè)，很多惡性腫瘤患者經(jīng)過(guò)化療后機(jī)體免疫狀況的下降，很可能與化療藥物引起機(jī)體T淋巴細(xì)胞FADD表達(dá)變化有關(guān)，F(xiàn)ADD可成為篩選化療藥物和化療方案的一個(gè)重要因子；同時(shí)，通過(guò)改變機(jī)體免疫系統(tǒng)FADD的表達(dá)來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸也成為可能。

FADD不僅與細(xì)胞凋亡有關(guān)，還參與細(xì)胞周期的調(diào)控，與細(xì)胞增殖有關(guān)［12-13］。在此次試驗(yàn)中，并未驗(yàn)證人肺癌細(xì)胞A549作用導(dǎo)致Jurkat細(xì)胞中FADD改變的情況是否與細(xì)胞周期相關(guān)。在肺癌發(fā)病過(guò)程中，肺癌細(xì)胞是否通過(guò)改變宿主T淋巴細(xì)胞FADD的表達(dá)，影響T淋巴細(xì)胞的增殖，從而影響機(jī)體的免疫能力，還有待進(jìn)一步研究。

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Role of FADD in apoptosis of T lymphocyte induced by human lung carcinoma cell A549

WANG Hong-mei,ZHANG Guo-qiang, MIN Jia-xin(Department of Thoracic Surgery, Xinqiao Hospital, the Third Military University, Chongqing 400037, China)

ZHANG Guo-qiang E-mail：Zhang006006@163.com

Background and purpose：Studies have conf i rmed that one mechanism of immune evasion in lung cancer is apoptosis, and the Fas associated death domain (FADD) is important in the process. This study aimed to investigate the function of Fas associated death domain (FADD) in apoptosis of T lymphocyte induced by human lung carcinoma cell A549.Methods：Human T lymphocytes (Jurkat cells) had been cocultured with human lung carcinoma cells (A549) for 0, 2, 4 and 6 h.Apoptosis rates of Jurkat cells was assessed by fl ow cytometry, the protein and mRNA expression of FADD in Jurkat cells were detected respectively by RT- PCR and Western blot.Results：There were time dependence significance in apoptosis rates and FADD expressions in Jurkat cells (P＜0.05).Conclusion：Changes of the FADD expression in T lymphocytes induced by human lung carcinoma cells play an important role in immune evasion of human lung carcinoma cells,it may facilitate the apoptosis of T lymphocytes and depress the immune competence.

Lung cancer; FADD; Apoptosis

10.3969/j.issn.1007-3969.2011.06.007

R734.2

A

1007-3639(2011)06-0457-04

張國(guó)強(qiáng) E-mail:Zhang006006@163.com

2011-03-04

2011-06-02）