人肺腺癌細胞株A549中HIF-1α對survivin的表達調(diào)控

李偉 陳余清 孫艷 趙成嶺 王效靜

蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院呼吸科，安徽省呼吸系病基礎(chǔ)與臨床省級重點實驗室，安徽 蚌埠 233003

人肺腺癌細胞株A549中HIF-1α對survivin的表達調(diào)控

李偉 陳余清 孫艷 趙成嶺 王效靜

蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院呼吸科，安徽省呼吸系病基礎(chǔ)與臨床省級重點實驗室，安徽 蚌埠 233003

背景與目的：survivin是一種重要的抗凋亡基因，在腫瘤組織中特異性高表達，并參與調(diào)控細胞周期和細胞凋亡，其高表達與腫瘤進展、藥物抵抗以及預(yù)后關(guān)系密切。但survivin在肺癌中高表達的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制研究甚少。課題組前期研究成功構(gòu)建含有survivin核心啟動子的熒光報告載體pGL3-SVP230-luc，并發(fā)現(xiàn)核心啟動子區(qū)存在缺氧誘導因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)的潛在位點。本研究擬通過免疫熒光雙標記法、電泳遷移率實驗(EMSA)、共轉(zhuǎn)染等方法探討缺氧條件下人肺腺癌細胞株A549中HIF-1α調(diào)控survivin轉(zhuǎn)錄的確切機制。方法：⑴運用免疫熒光雙標記檢測缺氧A549細胞中HIF-1α與survivin的表達；⑵HIF-1α表達質(zhì)粒和HIF-1αsiRNA分別轉(zhuǎn)染A549細胞，30 h后RT-PCR、Western blot和免疫熒光雙標法檢測survivin mRNA和蛋白表達；⑶pGL3-SVP230-luc(含有survivin核心啟動子的熒光報告載體)與HIF-1α表達質(zhì)粒和HIF-1α siRNA分別共轉(zhuǎn)染A549細胞，測定螢光素酶的表達活性；⑷EMSA分析HIF-1α與survivin核心啟動子結(jié)合情況；(5)流式細胞術(shù)和MTT法檢測細胞凋亡和增殖。結(jié)果：⑴HIF-1α與survivin共表達于A549細胞中；⑵轉(zhuǎn)染HIF-1α表達質(zhì)粒組survivinmRNA和蛋白表達水平顯著上調(diào)，轉(zhuǎn)染HIF-1α siRNA組survivin mRNA和蛋白表達顯著降低(P＜0.01)；⑶HIF-1α表達質(zhì)粒組pGL3-SVP230-luc相對活性分別為78.84，顯著高于空質(zhì)粒組及對照組(P＜0.01)，HIF-1αsiRNA組pGL3-SVP230-luc相對活性分別為28.84，顯著低于空質(zhì)粒組及對照組(P均＜0.01)；⑷HIF-1α與survivin核心啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄起始點上游-19～-16 bp序列結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活survivin；⑸流式細胞術(shù)和MTT檢測結(jié)果顯示，HIF-1α siRNA組細胞凋亡顯著增加，細胞抑制率明顯升高，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P均＜0.01)。結(jié)論：缺氧狀態(tài)下A549細胞中survivin與HIF-1α存在共表達；HIF-1α可以通過survivin核心啟動子區(qū)的結(jié)合位點激活survivin轉(zhuǎn)錄和表達；靶向HIF-1α可以誘導細胞凋亡、抑制細胞增殖，并為survivin的靶向治療研究提供了進一步的實驗基礎(chǔ)。

缺氧誘導因子-1α；survivin； 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)； 非小細胞肺癌

癌基因的激活和(或)抑癌基因失活導致細胞的增殖異常和凋亡障礙可能是肺癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵。survivin基因是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis proteins，IAPs)基因家族的關(guān)鍵成員，是迄今為止作用最強的凋亡抑制因子，高表達于多數(shù)惡性腫瘤組織中［1］，其在肺癌的表達率達70.7%～96.0%［2-3］，survivin高表達與腫瘤的惡性程度、藥物抵抗以及患者預(yù)后關(guān)系密切［1］。涉及survivin在肺癌中高表達的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制研究甚少。缺氧是實體瘤中普遍存在現(xiàn)象，不僅會導致腫瘤細胞對放化療抵抗，而且使腫瘤細胞更具侵襲性，其中缺氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)起關(guān)鍵作用，其在多種腫瘤中高表達［4］。轉(zhuǎn)染反義HIF-1α至胰腺癌細胞株BxPc-3后，HIF-1α和survivin的表達均下調(diào)，提示HIF-1α可能調(diào)控survivin表達［5］。Chen等［6］前期的研究證實，缺氧可誘發(fā)肺腺癌細胞株A549中survivin啟動子活性增強。survivin核心啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄起始點上游-19～-16 bp和-144～-127 bp處存在HIF-1α潛在結(jié)合位點。構(gòu)建-19～-16 bp堿基序列突變的螢光素酶報告基因載體pGL3-SVP229-luc，轉(zhuǎn)染A549細胞，啟動子活性下降36.6%。表明上述位點在正調(diào)控survivin表達中起重要作用。本研究將用RTPCR、共轉(zhuǎn)染等方法確證HIF-1α對survivin的表達調(diào)控作用，并結(jié)合電泳遷移實驗(EMSA)結(jié)果探討HIF-1α調(diào)控survivin轉(zhuǎn)錄的確切機制。

1 材料和方法

1.1 細胞和試劑

人肺腺癌A549細胞由本實驗室保存。pGL3-SVP-230-luc也由本實驗室前期構(gòu)建并保存［6］。HIF-1α的真核表達質(zhì)粒由美國伊利諾斯州立大學錢峰博士后惠贈。EMSA、螢光素酶報告基因檢測試劑盒購自Promega公司。PCR引物、survivin探針由上海生物工程有限公司合成。r-32P［ATP］購自北京市福瑞生物工程公司。鼠抗人HIF-1α單克隆抗體購自SantaCruz公司，兔抗人survivin單克隆抗體、DyLightTM488標記山羊抗鼠IgG以及DyLightTM594標記羊抗兔IgG均購自北京中山生物技術(shù)公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和缺氧處理

將本實驗室保存A549細胞復(fù)蘇后并接種于含10%滅活小牛血清新鮮DMEM培養(yǎng)基液中，CO2體積分數(shù)為5%，37 ℃條件下常規(guī)培養(yǎng)。A549細胞株用COCl2150 μmol/mL處理，模擬腫瘤內(nèi)部缺氧微環(huán)境，置于常規(guī)培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后收獲細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.2 激光共聚焦檢測A549細胞中HIF-1α和survivin蛋白的表達

雙標免疫熒光法檢測參照Bemardini等［7］介紹的方法進行。4%甲醛固定，PBS液反復(fù)漂洗，加入1%BSA稀釋的survivin兔抗人單抗和HIF-1α鼠抗人單抗(按1∶1混勻)，4 ℃溫育過夜；PBS充分漂洗后加DyLightTM488標記羊抗鼠IgG(1∶30)、DyLightTM594(1∶40)標記羊抗兔IgG，滴加到切片上，甘油封片。利用激光共聚焦顯微鏡觀察并攝像。

1.2.3 HIF-1α表達質(zhì)粒和HIF-1α siRNA分別轉(zhuǎn)染A549細胞，檢測survivin表達

1.2.3.1 質(zhì)粒的制備和純化

制備JM109感受態(tài)細菌。50 μL感受態(tài)細胞懸液和1 μL pcDNA3.0-HIF-1α或者pGL3-SVP-230-luc振動、混勻，加入1 mL無氨芐的液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)液均勻涂至LB/氨芐平板上，37 ℃培養(yǎng)16 h。用Takara Minibest Plasmid Purification kit2.0說明制備和純化質(zhì)粒。在質(zhì)粒表達載體平板劃菌后，挑取白色單克隆菌落，在含氨芐青LB液體培養(yǎng)基37 ℃過夜震蕩培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，1%瓊脂糖電泳證實質(zhì)粒片段大小，并送少許菌液經(jīng)上海生工測序部測序鑒定。

1.2.3.2 HIF-1α siRNA的設(shè)計、合成

按本實驗既往證實針對H I F-1 α基因(NM001530)1 521～1 541堿基的有效siRNA序列設(shè)計［6］，由上海生物工程有限公司合成。序列如下：正義鏈 5’-CUGAUGAC CAGCAACUUGAdTdT-3’， 反義 鏈5’-UCAAGUUGCUGGUCAUCAGdTdT-3’；同時合成熒光標記的陰性對照control siRNA：正義鏈5’-AGUUCAACGACCAGUAGUCdTdT-3’，反義鏈5’-GACUACUGGUCGUUGAdTdT-3’。根據(jù)預(yù)實驗確定最佳轉(zhuǎn)染濃度為5O nmol/L。將熒光標記的control siRNA和HIF-1α siRNA分別按50 nmol/L的終濃度轉(zhuǎn)染A549細胞，轉(zhuǎn)染后12、18和24 h用熒光顯微鏡觀察熒光陽性細胞，檢測轉(zhuǎn)染效率。同時RT-PCR檢測HIF-1α mRNA表達證實干擾效果。

1.2.3.3 細胞轉(zhuǎn)染

106個A549細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，細胞融合達到70%～90%時進行轉(zhuǎn)染；設(shè)立以下5組：pcDNA3.0-HIF-1α組、HIF-1α siRNA組、pcDNA3.0組、control siRNA組和control組(空白對照組)。轉(zhuǎn)染程序按照LipofectamineTM2000說明書進行。工作質(zhì)粒與內(nèi)參質(zhì)粒 pRL-TK按等摩爾濃度共轉(zhuǎn)染A549。質(zhì)粒的用量為每孔2 μg，內(nèi)參質(zhì)粒用量為每孔0.2 μg，siRNA轉(zhuǎn)染濃度見上，LipofectamineTM2000用量為每孔10 μL。實驗重復(fù)3次(下同)。

1.2.3.4 RT-PCR法檢測survivin mRNA表達

轉(zhuǎn)染3 0 h收集各組細胞，提取總RNA，并用M-MLA反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA；以cDNA為模板進行PCR擴增，以β-actin為內(nèi)參照。survivin基因上游引物為5’-AGGTCATCTCGGCTGTTCCTG-3’，下游引物為5’-TCATCCTCACTGCGGCTGTC-3’；β-actin基因上游引物為5’-GAGACCTTCA ACACCCCAGCC-3’；下游引物為5’-GGCCATC TCTTGCTCGAAGTC-3’。survivin和β-actin的PCR擴增產(chǎn)物片段的長度分別為147 bp和311 bp。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性50 s，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min(共32個循環(huán))；72 ℃終延伸10 min。擴增后的產(chǎn)物行1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，溴化乙錠染色，再經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)成像，用Gelworks l D Advanced v4.01軟件進行條帶灰度分析。

1.2.3.5 Western blot檢測survivin蛋白表達

分組同上。轉(zhuǎn)染30 h收集各組細胞，裂解細胞抽提蛋白，取40 μg總蛋白行l(wèi)0%SDSPAGE分離蛋白，分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入survivin鼠抗人單克隆抗體(終質(zhì)量濃度為0.5 μg/mL)4 ℃反應(yīng)過夜，TBST洗膜后，加1∶4 000稀釋的辣根過氧化物酶標記的二抗，用Ultra ECL發(fā)光劑檢測。

1.2.3.6 激光共聚焦檢測各處理組細胞HIF-1α和survivin蛋白表達

分組同上。轉(zhuǎn)染30 h后加入survivin兔抗人單抗和HIF-1α鼠抗人單抗(按1∶1混勻)，步驟同1.2.2。

1.2.4 HIF-1α表達質(zhì)粒和HIF-1 αsiRNA和報告基因共轉(zhuǎn)染A549細胞，檢測報告基因螢光素酶活性

1.2.4.1 HIF-1α表達質(zhì)粒和報告基因共轉(zhuǎn)染

缺氧處理后的106個A549細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，細胞融合達到70%～90%時進行轉(zhuǎn)染；設(shè)立以下3組：pGL3-SVP 230-luc轉(zhuǎn)染組(陰性對照組)、pGL3-SVP 230-luc與pcDNA3.0-HIF-1α共轉(zhuǎn)染組、pGL3-SVP-230-luc與pcDNA3.0共轉(zhuǎn)染組。質(zhì)粒和LipofectamineTM2000用量同上。操作依照說明書進行。

1.2.4.2 HIF-1α siRNA和報告基因共轉(zhuǎn)染

設(shè)立以下各組： HIF-1α siRNA組、control siRNA組，單獨pGL3-SVP 230-luc轉(zhuǎn)染組(陰性對照組)。siRNA濃度和轉(zhuǎn)染程序同上。siRNA轉(zhuǎn)染入A549細胞24 h后，pGL3-SVP 230-luc再次轉(zhuǎn)染該細胞。

1.2.4.3 螢光素酶活性分析

各組細胞在報告基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染30 h后采用雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒檢測螢光素酶活性，操作步驟參照Promega檢測試劑盒說明書。

1.2.5 EMSA實驗

細胞核蛋白抽提和濃度測定：核蛋白抽提參考文獻［7］的方法。用B C A法測定核蛋白濃度；雙鏈寡核苷酸探針設(shè)計如下。探針1：survivin啟動子序列(轉(zhuǎn)錄起始區(qū)上游-26～-9 bp)，正義鏈5’-GAGGGCGTGCGCTCCCGA-3’，反義鏈5’-TCGGGAGCGCACGCCCTC-3’；探針2：s u r v i v i n啟動子序列(轉(zhuǎn)錄起始區(qū)上游-144 bp～-127 bp)，正義鏈5’-GTCGCTGGGTGCACCGCG-3’；反義鏈5’-CGCGGTGCACCCAGCGAC-3’；突變探針1：正義鏈5’-GAGGGCAGCGCTCCCGA-3’，反義鏈5’-TCGGGAGCGCTGCCCTC-3’；突變探針2：正義鏈5’-GTCGCTGGAGCACCGCG-3’，反義鏈5’-CGCGGTGCTCCAGCGAC-3’。98 ℃加熱探針15 min，自然冷卻使其退火.用r-32P［ATP］標記探針，G25 Sephadex柱純化探針。EMSA按Promega公司提供的試劑盒操作程序進行。

1.2.6 流式細胞術(shù)(FCM)檢測早期細胞凋亡

設(shè)立以下5組：pcDNA3.0-HIF-1α組、HIF-1αsiRNA組、pcDNA3.0組、control siRNA組和control組。轉(zhuǎn)染48 h后胰酶消化至單細胞懸液狀態(tài)，1 500 r/min常規(guī)離心15 min(離心半徑15 cm)，PBS清洗，往100 μL細胞懸液中加入5 μL Annexin V/FITC和10 μL 20 μg/mL的碘化丙啶溶液，混勻后于室溫避光溫育15 min。流式細胞儀通過cell Quest收集并檢測104個細胞進行分析。

1.2.7 MIT法觀察A549細胞增殖

分組同上。轉(zhuǎn)染48 h后，在每組的3個平行孔中加入四甲基偶氮唑藍(MTT，濃度為5 mg/mL)100 μL，置37 ℃，CO2體積分數(shù)為5%的溫箱中繼續(xù)溫育4 h，小心棄上清液，加入二甲亞砜100 μL，振蕩5 min，用Bio-Rad酶標儀在570 nm處讀取吸光度值(D值)。細胞增殖抑制率=(1-D實驗組平均值/D對照組平均值)×100%。

1.3 統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據(jù)用表示，應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，多組比較進行單因素方差分析，兩兩比較進行LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 HIF-1α和survivin蛋白在A549細胞中的表達

HIF-1α陽性表達呈綠色熒光，survivin陽性表達呈紅色熒光，兩者在同一位置共表達呈黃色熒光。結(jié)果發(fā)現(xiàn)HIF-1α和survivin在A549細胞質(zhì)和細胞核同一位置存在共表達(圖1)。

2.2 外源性轉(zhuǎn)錄因子HIF-1α及其siRNA對survivin mRNA和蛋白表達的影響

HIF-1α表達質(zhì)粒的測序結(jié)果與Genbank公布的HIF-1α標準序列比對，發(fā)現(xiàn)同源性達到99.99%(圖2)。RT-PCR結(jié)果表明，與對照干擾序列相比，HIF-1α siRNA可以下調(diào)HIF-1α mRNA水平達78.3%，具有良好的干擾效果，完全能滿足后續(xù)實驗的要求。pcDNA3.0-HIF-1α組和HIF-1α siRNA組survivin mRNA相對表達強度分別為0.70±0.06和0.11±0.03，與各對照組相比，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01，圖3)。Western blot結(jié)果顯示，pcDNA3.0-HIF-1α組survivin蛋白表達強度為0.73±0.06，顯著高于對照組(P＜0.01)，HIF-1α siRNA組為0.11±0.02，顯著低于對照組(P＜0.01，圖4)。激光共聚焦檢測顯示，HIF-1α siRNA轉(zhuǎn)染后兩者表達的熒光強度明顯減弱(圖5)。

2.3 A549細胞中外源性轉(zhuǎn)錄因子HIF-1α對survivin核心啟動子活性的影響

pGL3-SVP230-luc與pcDNA3.0-HIF-1α共轉(zhuǎn)染A549細胞30 h后檢測螢光素酶的活性，結(jié)果顯示pcDNA3.0-HIF-1α組熒光素酶活性為78.8±6.4，顯著高于pcDNA3.0轉(zhuǎn)染組36.4±4.1和對照組32.4±2.6(P＜0.01)，而空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性與對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05，圖6)。

2.4 A549細胞中HIF-1α siRNA對survivin核心啟動子活性的影響

HIF-1αsiRNA處理組螢光素酶的活性為8.1±1.3，顯著低于control siRNA組26.1±4.1和對照組30.1±5.2(P＜0.01)，而control siRNA組熒光素酶活性與對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05，圖7)。

2.5 EMSA確認HIF-1α與survivin核心啟動子區(qū)-19～-16 bp位點的結(jié)合

樣品反應(yīng)中探針1序列(轉(zhuǎn)錄起始點上游-26～-9 bp)與核蛋白作用，自顯影后出現(xiàn)DNA-核蛋白結(jié)合的滯后條帶；探針冷競爭反應(yīng)中，100倍量的未標記探針競爭掉標記探針；突變探針冷競爭反應(yīng)則觀察到了結(jié)合條帶；為了證實本實驗所提取的核蛋白含有HIF-1α，核蛋白預(yù)先加入HIF-1α抗體處理，再加入標記探針，Super-shift反應(yīng)中自顯影后出現(xiàn)DNA-核蛋白結(jié)合條帶及Super-shift結(jié)合條帶(圖8)。探針2序列(-144～-127 bp)與核蛋白作用，未出現(xiàn)DNA-核蛋白結(jié)合滯后條帶。表明HIF-1α僅與-26～-9 bp片段發(fā)生結(jié)合。

2.6 轉(zhuǎn)染HIF-1α及其siRNA對A549細胞凋亡的影響

pcDNA3.0-HIF-1α組和HIF-1αsiRNA組細胞凋亡情況見圖9，分別為1.92±0.28和20.85±2.92，與各對照組相比，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。

2.7 轉(zhuǎn)染HIF-1α及其siRNA對A549細胞增殖的影響

pcDNA3.0-HIF-1α組和HIF-1αsiRNA組細胞抑制率分別為(61.3±7.6)%和(4.1±1.2)%，與各對照組相比，差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。

3 討 論

survivin是從人類基因庫雜交篩選分離出的一種獨特的凋亡抑制基因，定位于染色體17q25區(qū)，全長14.7 kb，由3個內(nèi)含子和4個外顯子組成，編碼142個氨基酸［1］，調(diào)控survivin表達的關(guān)鍵環(huán)節(jié)在轉(zhuǎn)錄水平［8］。本課題組前期研究證實，survivin的核心啟動子區(qū)位于-203 bp～＋64 bp處，該區(qū)域存在Sp1、E2F和p53等轉(zhuǎn)錄因子識別位點［9］。但迄今為止，對于survivin在肺癌中高表達的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制尚不清楚。

缺氧可誘發(fā)腫瘤細胞survivin啟動子活性增強，HIF-1α可能在此機制中發(fā)揮重要作用［10］。乏氧環(huán)境下，HIF-1α表達顯著增加，并與HIF-1β形成異二聚體，與腫瘤相關(guān)基因的缺氧反應(yīng)元件(hypoxia response element，HRE)結(jié)合，影響下游基因轉(zhuǎn)錄活性［11］。在前列腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，survivin和HIF-1α共同高表達，并促進了前列腺癌的侵襲和增殖，肺癌中是否存在類似現(xiàn)象尚未見報道［12］。

本研究采用免疫熒光雙標法檢測缺氧處理后A549細胞中survivin和HIF-1α的表達，結(jié)果顯示，survivin和HIF-1α在細胞質(zhì)和細胞核同一位置存在共表達，表明HIF-1α和survivin在肺癌中存在表達的相關(guān)性。我們既往曾用免疫組化法觀察120例NSCLC患者肺癌組織的survivin和HIF-1α蛋白表達水平，其表達率分別為81.60%(98/120)和58.33%(70/120)，兩者表達呈顯著正相關(guān)［13］。與本實驗結(jié)果相吻合。RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示，HIF-1α表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549細胞后，survivin mRNA和蛋白表達較對照組分別上調(diào)了113%和95%，證實HIF-1α對survivin表達起正調(diào)控作用，而轉(zhuǎn)染HIF-1α siRNA，則顯著下調(diào)了survivin表達，從反面證實上述調(diào)控作用。這與Chang等［5］在胰腺癌中的研究結(jié)果類似：反義HIF-1α降低了胰腺癌BxPc-3細胞的HIF-1α和survivin表達。

本研究在體外共轉(zhuǎn)染實驗中進一步探討了HIF-1α對survivin啟動子活性的影響。HIF-1α表達質(zhì)粒與pGL3-SVP230-luc共轉(zhuǎn)染A549細胞后survivin啟動子活性顯著增高，而 HIF-1α siRNA干擾HIF-1α后，啟動子活性下調(diào)，上述結(jié)果從正反兩方面證實了A549細胞中HIF-1α是導致survivin轉(zhuǎn)錄激活的重要轉(zhuǎn)錄因子之一。

前期的生物信息學分析表明，survivin核心啟動子轉(zhuǎn)錄起始點上游-19～-16 bp和-144～-127 bp處存在HIF-1α潛在結(jié)合位點［9］，本課題組構(gòu)建包含-19～-16 bp突變序列的螢光素酶報告基因載體，轉(zhuǎn)染A549細胞，啟動子活性下降36.6%，而突變-144～-127 bp關(guān)鍵序列，survivin核心啟動子活性無顯著變化［6］。據(jù)此推測，HIF-1α可能與-19～-16 bp序列直接結(jié)合調(diào)控survivin轉(zhuǎn)錄。本研究利用EMSA技術(shù)驗證上述推測。EMSA是一種體外證實目的蛋白與靶DNA直接結(jié)合的方法。我們提取A549細胞核蛋白，分別與經(jīng)r-32P標記的survivin啟動子序列-26～-9 bp和-144～-127 bp兩處HIF-1α潛在結(jié)合位點作用。結(jié)果表明，-26～-9 bp片段與核蛋白結(jié)合。且該復(fù)合物可以與HIF-1α特異性抗體結(jié)合。突變-19～-16 bp序列的部分堿基后，序列不能競爭survivin啟動子序列-26～-9 bp與核蛋白的結(jié)合。因此survivin核心啟動子-19～-16 bp區(qū)是HIF-1α的結(jié)合位點。而-144～-127 bp序列沒有與核蛋白形成復(fù)合物條帶，提示-144～-127 bp處可能不存在HIF-1α結(jié)合位點，這與Peng等［14］在乳腺癌細胞中的研究不完全吻合。張曉潔等［15］在研究轉(zhuǎn)錄因子Sp1對survivin轉(zhuǎn)錄調(diào)控的分子機制時亦遇到了類似現(xiàn)象，推測造成這種差異的部分原因可能與轉(zhuǎn)錄調(diào)控存在細胞類型特異性和刺激的依賴性有關(guān)。此外，基因的調(diào)控是由多條相互作用的信號通路構(gòu)成的網(wǎng)絡(luò)來實現(xiàn)的。缺氧的A549細胞中，HIF-1α與notch1信號途徑協(xié)調(diào)調(diào)控survivin轉(zhuǎn)錄［16］。HIF-1α對survivin的調(diào)控是否還與其他上游信號通路發(fā)生交互作用，及有無HIF-1α與其余反式作用因子形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的可能，尚需深入探討。

本研究還發(fā)現(xiàn)，HIF-1α siRNA轉(zhuǎn)染A549細胞后，不僅有效沉默靶基因survivin，而且抑制A549細胞增殖，促進細胞凋亡，提示干預(yù)HIF-1α可成為治療survivin高表達肺癌的一種新手段。

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Regulation ofsurvivinexpression by hypoxia–inducible factor-1α in non-small cell lung cancer

LI Wei, CHEN Yu-qing, SUN Yan, ZHAO Cheng-ling, WANG Xiao-jing(Department of Respiratory Disease, First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College, Provincial Key Laboratory of Respiratory disease in Anhui, Bengbu Anhui 233004, China)

CHEN Yu-qing E-mail：bbmccyq@126.com

Background and purpose：Survivingene is a unique member of the inhibitor of apoptosis protein(IAP) family. It plays an important role, not only in regulating mitosis but also in inhibiting apoptosis. It is highly expressed in almost all types of human tumors and fetal tissues but rarely detectable in normal adult tissues. High levels ofsurvivinexpression have been associated with tumor progression, resistance to radiation and drug treatments and poor survival rates in cancer patients. The current literature contains few reports on the transcriptional regulation ofsurvivinexpression in lung cancer. Previous studies have found that there are also 2 putative binding sites for hypoxiainducible factor-1α(HIF-1α) in the core promoter region ofsurvivingene.Survivinpromoter-luciferase reporter vectors pGL3-SVP230-luc have been constructed early. The purpose of this study was to investigate the mechanism of (HIF-1α)on transcriptional regulation ofsurvivinin A549 cells by hypoxia.Methods：⑴Double labeling immunof l uorescence method was used to detect co-expression of survivin/HIF-1α protein; ⑵RT-polymerase chain reaction (RT-PCR)and Western blot was used to examine the level of survivin mRNA and protein in A549 cells transfected by HIF-1α expression plasmid and HIF-1α siRNA; ⑶Luciferase activity was detected in A549 cells following cotransfection with pGL3-SVP230-luc as well as HIF-1α expression plasmid or HIF-1α siRNA to value the transcriptional activity ofsurvivin. ⑷Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) was performed to test the nuclear extract of the A549 cells binding to the r-32P labeled probes containing survivin promoter squences.Results：⑴Survivin/HIF-1α proteins coexpressed in A549 cell; ⑵Compared with control groups, the level of survivin mRNA and protein is markedly increased in A549 cells transfected with HIF-1α expression plasmid, but decreased in the HIF-1α siRNA group(P＜0.01); ⑶The relative activity of pGL3-SVP230-luc in A549 cells transfected with HIF-1α expression plasmid was 78.84, which was significantly higher than that of both the pcDNA3.0 and the negative control group in the A549 cells (P＜0.01),but was significantly lower in the HIF-1α siRNA group (P＜0.01); ⑷DNA-neucleoprotein bands were observed when A549 nuclear extracts incubating with the r-32P labeled -18 bp probe (nucleotides -26 to -9) ofsurvivincore promoter in EMSA assay. The specific bands were competed away by the cold 18 bp probe, but not the mutated cold probe in competition assay. Binding bands exhibited in Super-shift reaction. ⑸The proliferation of A549 cells was inhibited after transfection with HIF-1α siRNA. Cell apoptosis was significantly increased in HIF-1α siRNA group compared to negative control group (P＜0.01).Conclusion：The binding of HIF-1α to thesurvivincore promoter (nucleotides-19 to -16 bp in its 5’ fl anking region) increases transcription and expression of thesurvivingene. These observations have significant implications for understanding the part molecular mechanism ofsurvivintranscriptional regulation in lung cancer.

HIF-1α;survivin; Transcriptional regulation; NSCLC

10.3969/j.issn.1007-3969.2011.06.002

R734.2

A

1007-3639(2011)06-0427-08

國家自然科學基金資助項目(No: 30772532)；安徽省自然科學基金資助項目(No: 070413094)。

陳余清 E-mail:bbmccyq@126.com

2011-01-20

2011-05-15）