羧甲基殼聚糖季銨鹽作為基因載體及動物體內(nèi)分布研究

李曉昱 梁曉飛 朱明潔 孫彥明 段友容

上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院腫瘤研究所，上海交通大學腫瘤研究所, 上海 200032

基因療法是治療腫瘤的新手段［1-2］。但目前面臨的主要障礙是缺乏合適的基因治療載體［3-4］。由于病毒性基因載體存在導向性差、攜帶能力低、免疫原性和潛在致瘤性等缺點［5］。因此，針對其缺點研制非病毒載體近來成為研究的熱點，主要包括真核細胞表達質(zhì)粒載體、陽離子聚合物［6-7］、陽離子脂質(zhì)體［8］和聚合物嵌段共聚物等。

殼聚糖是一種天然無毒的多糖，具有良好的生物降解性和生物相容性，并通過吸附DNA保護其免受酶的降解［2］。殼聚糖骨架上豐富的氨基和羥基使其易于化學修飾，有利于進一步提高遞送基因的效率［9］。已有許多體內(nèi)外實驗證實，殼聚糖及其衍生物是非病毒基因載體的合適材料［10］。含有長鏈烷基的親水性羧甲基殼聚糖季銨鹽具備了更好的溶解性和乳化性。這些性狀的改變，使其更加適合作為基因轉(zhuǎn)染材料。

本研究在模擬普通的陽離子脂質(zhì)體基因轉(zhuǎn)染系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，將脂質(zhì)體技術(shù)與納米聚合物膠束技術(shù)相結(jié)合，構(gòu)建新型陽離子高分子脂質(zhì)體(CPL)系統(tǒng)，并將其作為基因載體，探討其基因轉(zhuǎn)染效率及動物體內(nèi)分布，爭取最大限度地提高載體的基因轉(zhuǎn)染效率。其中CPL采用以殼聚糖季銨鹽為主體，選取長鏈不同烷基數(shù)目的殼聚糖季銨鹽，探討不同結(jié)構(gòu)的殼聚糖季銨鹽對轉(zhuǎn)染效率的影響。本研究通過檢測CPL納米粒在3種不同荷瘤裸鼠體內(nèi)的分布，為非病毒載體的基因轉(zhuǎn)染和基因治療提供有科學價值的實驗數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要材料

殼聚糖，具有99%脫乙酰度和相對分子質(zhì)量約為5×104和1×105，國藥集團化學試劑有限公司提供。十八烷基二甲基氯化銨甘油酯(QA)由本實驗室制備。質(zhì)粒DNA(pEGFP-C1質(zhì)粒和pGL3-對照載體)由本實驗室保存，提取自培養(yǎng)的大腸埃希菌，質(zhì)粒抽提試劑盒購自Macherey-Nagel公司。瓊脂糖凝膠(0.8%)電泳分析表明，其以超螺旋質(zhì)粒的形式為主。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司。3-(4,5二甲基-2-噻唑)-2，5-diphenyltetrazolium溴(MTT)購自Amresco公司。6～7周齡BALB/c裸鼠由上海市第一人民醫(yī)院實驗室提供。其他所有的培養(yǎng)液和細胞培養(yǎng)中使用試劑均購自Hyclone公司。其他化學品均購自國藥集團化學試劑有限公司，并未進一步的純化。

1.2 CPL納米粒的制備與表征

1.2.1 CPL的制備

根據(jù)長鏈烷基數(shù)目不同，分別選取十二烷基二甲基氯化銨甘油酯、十四烷基二甲基氯化銨甘油酯、十六烷基二甲基氯化銨甘油酯、十八烷基二甲基氯化銨甘油酯為原料，根據(jù)文獻［11-13］的方法，制備十二烷基-羧甲基殼聚糖季銨鹽(DQCMC)、十四烷基-羧甲基殼聚糖季銨鹽(TQCMC)、十六烷基-羧甲基殼聚糖季銨鹽(CQCMC)、十八烷基-羧甲基殼聚糖季銨鹽(OQCMC)嵌段共聚物，相對分子質(zhì)量為2×104g/mol，季銨鹽的接枝率是105.0%。

1.2.2 CPL納米粒的制備

采用薄膜分散法制備CPL的過程如下：按照質(zhì)量比5∶4的比例，精確稱取殼聚糖季銨鹽和膽固醇10 mg和8 mg，加入到50 mL茄形瓶中，溶于2 mL氯仿中，然后在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上進行旋蒸，同時向旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中通入適當流速的氮氣流加以保護。當茄形瓶中形成一層透明均勻的脂質(zhì)膜后，繼續(xù)旋蒸15 min，稍微干燥后， 向茄形瓶中加入2 mL去離子水，將脂質(zhì)膜水化，然后用超聲波清洗器以99 w的功率進行超聲分散，直至形成半透明乳液，即得到陽離子高分子脂質(zhì)體溶液。

1.2.3 DNA/CPL納米粒的制備

DNA和CPL納米粒分別用Opti-MEM 100 μL稀釋。室溫下靜置10 min，漩渦震蕩3～5 s后，繼續(xù)靜置20 min，使DNA與納米粒緊密吸附在一起。

1.2.4 CPL納米粒的表征

利用動態(tài)光散射粒度分析儀(NICOMP 380 ZLS Zeta Potential/Particle Sizer, PSS Nicomp, and Santa Barbara, CA,USA)測定納米粒粒徑分布。所有的測量均在25℃時進行，測量角度為90°。

利用透射電子顯微鏡(TEM，HITACHI H-7650，Japan)觀察納米粒的形貌。用鑷子小心取出碳膜銅網(wǎng)，將膜面朝上(在燈光下觀察顯示有光澤的面，即膜面)，輕輕平放在白色濾紙上；然后滴2～3滴該混合液體到碳膜銅網(wǎng)上，至網(wǎng)上形成飽滿水滴而不流下為宜。靜置2～3 min后用濾紙在網(wǎng)下吸去多余水分，室溫干燥5 min。磷鎢酸染色10～20 min后，透射電子顯微鏡下觀察。

1.3 TQCMC納米粒細胞毒性實驗

以1×104細胞/孔的密度將L929細胞接種到96孔板中，在37 ℃，CO2體積分數(shù)為5%條件下溫育24 h后，分別加入20 μL終濃度分別為1、10、20、50、100 μg/mL的TQCMC，DNA/TQCMC，LipofectamineTM2000，DNA LipofectamineTM2000培養(yǎng)24 h后，每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 μL，37 ℃繼續(xù)溫育4 h，終止培養(yǎng)。小心吸取孔內(nèi)培養(yǎng)上清液后，每孔加入150 μL DMSO，溫育30 min。選擇490 nm波長，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀(Bio-RAD Model 550)上測定各孔吸光值。細胞活性按下列公式計算。

1.4 CPL納米粒體外轉(zhuǎn)染實驗

轉(zhuǎn)染前24小時將5×104個細胞接種到24孔板中，在37 ℃，CO2體積分數(shù)為5%條件下溫育18～24 h后至細胞融合度為70%～80%。轉(zhuǎn)染前將完全培養(yǎng)基吸去，用PBS洗滌2次，加入500 μL無血清培養(yǎng)基。分別將0.8 μg EGFP或者PGL3質(zhì)粒DNA和不同質(zhì)量比的TQCMC納米粒溶解與100 μL的opti-MEM培養(yǎng)液中，靜置5 min。再將兩者輕柔混合，室溫靜置20 min。將該混合物加入培養(yǎng)孔中溫育3 h后，置換無血清培養(yǎng)基為完全培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，流式細胞儀(Beckman Coulter Epics XL)檢測或按照熒光素酶報告基因檢測試劑盒(碧云天)所 提供的說明書在promega-20/20化學發(fā)光儀上檢測光子的強度。用BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天)檢測出總蛋白的濃度，從而將結(jié)果統(tǒng)一標準化成RLU/(mg·mL-1)蛋白(每毫克蛋白所對應(yīng)的相對光子數(shù))。

1.5 荷瘤裸鼠模型的構(gòu)建

分別取對數(shù)生長期人乳腺癌MDA-MB-231細胞、人卵巢癌HO8901細胞、人前列腺癌PC-3細胞于每只裸鼠(共54只)右后下肢皮下接種5×106/0.2 mL。確保皮丘飽滿無漏液，接種后每天觀察注射點有無紅腫破潰及裸鼠的一般情況。接種后14～20 d左右，接種點無紅腫、破潰。裸鼠形成單一皮下移植瘤，直徑約1.0 cm，即為模型構(gòu)建成功。

1.6 TQCMC納米粒在裸鼠體內(nèi)分布

分別將荷人乳腺癌MDA-MB-231、人卵巢癌HO8901、人前列腺癌PC-3裸鼠18只，稱重并隨機分為3組：DNA/CPL組(簡稱CPL組，DNA與CPL質(zhì)量比為1∶4)、DNA/LipofectamineTM2000(簡稱LipofectamineTM2000組，DNA與LipofectamineTM2000質(zhì)量比為1∶1)、質(zhì)粒DNA組(簡稱質(zhì)粒組)。每組6只，每只尾靜脈分別注射相應(yīng)的試劑200 μL(含質(zhì)粒DNA 40 mg溶于MEM培養(yǎng)液中)，于注射后48 h將3組裸鼠處死。每只裸鼠均取出肝、脾、腎、心、肺和腫瘤，用濾紙吸凈組織所帶血液，稱取組織的重量后放入EP管中。均漿組織后立即測定各組織的熒光素酶強度(RLU值)，并用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測出總蛋白的濃度，從而將結(jié)果統(tǒng)一為RLU/(mg·mL-1)蛋白(每毫克蛋白所對應(yīng)的相對光子數(shù))。

1.7 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 10.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)用表示，各組間差異用t檢驗或方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 CPL的形態(tài)、粒徑大小

經(jīng)過透射電鏡觀察，CPL納米粒大小均勻，形態(tài)規(guī)整。動態(tài)光散射粒度分析儀檢測得出，DQCMC、TQCMC、CQCMC和OQCMC的粒徑分別為114.5、120.5、125.1和170.1 nm。由此可知CPL的粒徑均在100～200 nm之間，并且隨著長鏈烷基數(shù)目的增加，納米粒粒徑逐漸增大。

2.2 CPL的體外轉(zhuǎn)染實驗結(jié)果

以熒光素酶載體pGL3-control為報告基因來觀察不同CPL對PC-3和293T細胞的基因轉(zhuǎn)染的情況。由圖1可見，CPL作為一種良好的基因載體，具有較高的轉(zhuǎn)染強度。其中尤以DQCMC和TQCMC轉(zhuǎn)染效果最佳，對于PC-3細胞達到106RLU/(mg·mL-1)，對于293T細胞達到109RLU/(mg·mL-1)。但是由于TQCMC較DQCMC在制備過程中產(chǎn)率更大，更易獲得，因此以下實驗均選取TQCMC為實驗對象。

按照D N A與T Q C M C質(zhì)量比1∶4的比例，以LipofectamineTM2000為陽性對照，以EGFP質(zhì)粒DNA為陰性對照，分別進行TQCMC納米粒對人胃腺癌細胞SGC7901、293T、人肝癌細胞SMMC-7721和人卵巢癌細胞HO8901進行體外轉(zhuǎn)染實驗。經(jīng)過流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)(圖2)，TQCMC納米粒的轉(zhuǎn)染效率雖然較LipofectamineTM2000略差，但在HO8901細胞中轉(zhuǎn)染效率相對較高，可作為一種有效的基因轉(zhuǎn)染載體。

2.3 TQCMC納米粒細胞毒性實驗結(jié)果

納米粒與L929細胞作用4 h后，根據(jù)MTT試驗計算生存率，當濃度為100 μg/mL時，TQCMC納米粒的生存率為76.15%，而LipofectamineTM2000已降至17.95%。與DNA復(fù)合后，納米粒的生存率略有下降，但仍較LipofectamineTM2000細胞毒性小(圖3)。MTT試驗結(jié)果與顯微鏡下形態(tài)學觀察基本吻合。

2.4 TQCMC納米載體在裸鼠體內(nèi)的分布

與LipofectamineTM2000相比，在荷人乳腺癌MDAMB-231裸鼠體內(nèi)TQCMC納米粒主要分布在心臟、腎臟和腫瘤組織中(圖4A)。TQCMC納米載體在荷人卵巢癌HO8901裸鼠體內(nèi)主要集中在肺臟、心臟、腎臟和腫瘤組織中(圖4B)。TQCMC納米載體在荷人前列腺癌PC-3裸鼠體內(nèi)分布于心臟、肝臟、肺臟和腫瘤組織中(圖4C)。但有一點值得注意，無論是陽性對照LipofectamineTM2000組還是實驗組CPL組，與陰性對照質(zhì)粒組的體內(nèi)分布差異很小。

3 討 論

目前很多殼聚糖的衍生物就是針對基因載體的要求進行制備的，殼聚糖季銨鹽就是其中之一。殼聚糖季銨鹽的種類有很多。高分子脂質(zhì)體水溶液中不易發(fā)生融合，穩(wěn)定性好，同時含有氨基和羧基等官能團，容易進行多功能化組裝［14］。TQCMC替代磷脂，成功制備了表面帶正電并含有氨基等官能團的陽離子高分子脂質(zhì)體TQCMC。以TQCMC為主體所構(gòu)成的陽離子高分子脂質(zhì)體所采用的原料殼聚糖和季銨鹽等，較易得到、價格低廉。相對于價格昂貴的LipofectamineTM2000，CPL成本的降低使其在各個領(lǐng)域大規(guī)模的應(yīng)用成為可能。

影響轉(zhuǎn)染效率的因素有很多，如培養(yǎng)基pH值、轉(zhuǎn)染時間、細胞種類、納米粒粒徑等［15］。本實驗所制備的納米粒均在100～200 nm之間，且隨著長鏈烷基數(shù)目的增加粒徑逐漸增大。粒徑再此區(qū)間的納米粒多可通 過胞吞途徑進入細胞，增強轉(zhuǎn)染效果。

基因載體的生物安全性一直以來備受關(guān)注。由MTT實驗可以看出，與LipofectamineTM2000相比，TQCMC的生物毒性明顯下降，其安全濃度有了顯著提高，為其在體內(nèi)廣泛應(yīng)用打下了基礎(chǔ)。為了驗證TQCMC轉(zhuǎn)染效率的廣適性，本研究針對4種不同的細胞進行轉(zhuǎn)染實驗。與LipofectamineTM2000相比，TQCMC的轉(zhuǎn)染效率仍有一定差距；但對于人卵巢癌HO8901細胞來說，TQCMC納米?？梢赃_到38.9%。由于納米顆粒表面含有氨基等官能團，因此很容易采用多種方法增強載體的基因轉(zhuǎn)染效率。如使用靶向試劑對其進行表面修飾而制備具有組織、細胞膜或細胞核靶向功能的納米基因載體系統(tǒng)；使用跨膜肽的修飾則可提高納米粒的跨細胞膜功能；也可將具有質(zhì)子海綿效應(yīng)的PEI復(fù)合到高分子脂質(zhì)體當中。

能否在體內(nèi)有效遞送基因是制約基因治療的瓶頸。雖然近年來許多非病毒載體發(fā)展迅猛，體外轉(zhuǎn)染效率有了很大提高，但生物安全性和體內(nèi)基因表達等問題大大阻礙了非病毒載體在臨床上的應(yīng)用。由TQCMC納米粒的裸鼠體內(nèi)分布實驗表明，對于不同腫瘤模型的裸鼠，TQCMC納米粒的分布有所區(qū)別，但總體而言，主要分布在肝臟，腎臟和腫瘤組織中，體現(xiàn)了TQCMC納米的代謝途徑。同時由于腫瘤組織特有的高通透性和滯留效應(yīng)(enhanced permeability and retention effect，EPR)，粒徑在150 nm左右的納米粒容易聚集在腫瘤組織內(nèi)，實現(xiàn)被動靶向。但是TQCMC納米粒與裸質(zhì)粒DNA組相比，其組織內(nèi)的富集并不高。這也說明了體內(nèi)環(huán)境的復(fù)雜性。設(shè)計并制備安全無毒，且能夠在體內(nèi)高效遞送基因的非病毒載體還有很多需要解決的問題。

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