成纖維細(xì)胞激活蛋白對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖、遷徙和侵襲的影響

溫秋婷 孫玉榮 李春紅 劉鴻宇 柏青楊

1齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2哈爾濱醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)教研室，黑龍江 哈爾濱 150081

成纖維細(xì)胞激活蛋白對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖、遷徙和侵襲的影響

溫秋婷1孫玉榮1李春紅2劉鴻宇2柏青楊1

1齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2哈爾濱醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)教研室，黑龍江 哈爾濱 150081

背景與目的：腫瘤間質(zhì)活化的成纖維細(xì)胞能表達(dá)成纖維細(xì)胞激活蛋白(fibroblast activation protein，F(xiàn)AP)，本研究通過體外實(shí)驗(yàn)研究FAP在卵巢癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷徙過程中的作用。方法：人類卵巢癌細(xì)胞系HO-8910PM體外培養(yǎng)，加入不同濃度的FAP(30、100和300 pmol/L)處理，用MTT法檢測FAP對(duì)HO-8910PM增殖的影響；細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測FAP對(duì)HO-8910PM遷徙能力的影響；Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)來研究FAP對(duì)HO-8910PM侵襲能力的影響。結(jié)果：MTT法及細(xì)胞生長曲線顯示FAP對(duì)卵巢癌細(xì)胞有促增殖作用，并呈時(shí)間、劑量依賴性；細(xì)胞劃痕試驗(yàn)結(jié)果顯示，不同濃度的FAP對(duì)卵巢癌細(xì)胞系的遷徙均有促進(jìn)作用，以100 pmol/L組最為明顯(P＜0.01)；Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)顯示FAP對(duì)卵巢癌細(xì)胞有促侵襲作用，以100 pmol/L組最為明顯(P＜0.01)。結(jié)論：FAP具有促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖、遷徙和侵襲的作用。

成纖維細(xì)胞激活蛋白； 腫瘤轉(zhuǎn)移； 卵巢癌細(xì)胞系HO-8910PM

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)三大惡性腫瘤之一，卵巢癌浸潤、轉(zhuǎn)移是造成卵巢癌死亡率高的主要原因，因此對(duì)其浸潤和轉(zhuǎn)移機(jī)制研究已成為熱點(diǎn)。越來越多的研究證實(shí)，腫瘤的生物學(xué)特性不僅由癌基因和抑癌基因來調(diào)控，還依賴于間質(zhì)形成的微環(huán)境作用。腫瘤細(xì)胞通過誘導(dǎo)基質(zhì)(尤其是成纖維細(xì)胞)的活化，使成纖維細(xì)胞表達(dá)一些蛋白酶來參與侵襲和轉(zhuǎn)移過程［1］，腫瘤間質(zhì)中的成纖維細(xì)胞能表達(dá)多種蛋白酶，包括成纖維細(xì)胞激活蛋白(fibroblast activation protein，F(xiàn)AP)，盡管一些惡性腫瘤細(xì)胞也能產(chǎn)生蛋白酶，但主要還是由宿主的間質(zhì)產(chǎn)生［2］。

FAP屬Ⅱ型膜結(jié)合型糖蛋白，是脯氨?；禺惖慕z氨酸寡肽酶家族(prolyl peptidase)成員之一，能專一性水解多肽中脯氨酸殘基的氨基端肽鍵，具有二肽基肽酶和膠原酶的活性［1］。FAP在正常人組織中一般無表達(dá)，僅選擇性表達(dá)于腫瘤微環(huán)境、愈合的創(chuàng)面及器官的生理性重建等［3-5］。因此，F(xiàn)AP在腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞上的表達(dá)對(duì)形成促進(jìn)腫瘤生長的微環(huán)境十分重要。

1 材料和方法

1.1 材料

高轉(zhuǎn)移性卵巢癌細(xì)胞系HO-8910PM購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所，用含10%小牛血清(香港耐肯博國際生物有限公司)的RPMI-1640培養(yǎng)基(美國Thermo公司)培養(yǎng)。FAPα純化蛋白購自中國臺(tái)灣Abnova公司，基質(zhì)膠購自美國BD Biosciences公司。

1.2 方法

1.2.1 卵巢癌細(xì)胞系HO8910-PM的培養(yǎng)和傳代

凍存細(xì)胞復(fù)蘇后用完全培養(yǎng)基RPMI-1640將細(xì)胞接種密度調(diào)整為4×105～5×105mL-1，于37 ℃，CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日更換1次培養(yǎng)液。取生長狀態(tài)達(dá)到平臺(tái)期的細(xì)胞進(jìn)行下面的實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 MTT比色法測增殖實(shí)驗(yàn)

將HO8910PM接種(4.0×104mL-1)于96孔組織培養(yǎng)板中培養(yǎng)12 h，含有5% FBS的培養(yǎng)基。換成含有0.1% FBS的培養(yǎng)基，細(xì)胞用不同劑量的FAP α (0、100或300 pmol/L)處理，處理后的72 h內(nèi)，每隔12 h各孔中分別加入20 μL新鮮配制的MTT溶液，37 ℃溫育3 h。小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，各孔加入150 μL DMSO，輕輕搖勻使結(jié)晶物充分溶解，在D490nm處讀取各孔的吸光值。

1.2.3 Wound Healing法測遷徙實(shí)驗(yàn)

將HO8910PM接種(5.0×105mL-1)于12孔板中培養(yǎng)12 h細(xì)胞單層鋪滿。用無菌的200 μL槍頭在單層細(xì)胞上劃痕，劃痕面積大約10 mm×1 mm。各孔加入含有0.1% FBS的培養(yǎng)基，細(xì)胞分別用0、30、100和300 pmol/L的FAPα處理，由于腫瘤細(xì)胞具有遷徙能力，隨著時(shí)間的延續(xù)劃痕會(huì)逐漸愈合，用FAPα處理12、24、36和48 h后在倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照，并用Image Pro Plus軟件計(jì)算劃痕愈合的面積。

1.2.4 Transwell小室法測侵襲實(shí)驗(yàn)

用Transwell小室法研究腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。將50 μL Matrigel基質(zhì)膠均勻涂布于Transwell小室的上表面，常規(guī)胰酶消化收集HO-8910PM細(xì)胞，清洗離心(1 500 r/min，離心半徑5.8 cm，5min)后懸浮于含0.1%BSA的無血清培養(yǎng)基中，并計(jì)數(shù)1.1×106mL-1，每個(gè)Transwell小室內(nèi)均勻滴加170 μL，各小室分別加入FAPα 0、30、100和300 pmol/L，下室加含有10% FBS的PRMI-1640培養(yǎng)基。48 h后用棉簽擦去上室內(nèi)沒有侵襲過去的細(xì)胞，取下小室膜進(jìn)行HE染色，在顯微鏡下隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野計(jì)數(shù)每個(gè)膜侵襲過來的細(xì)胞數(shù)量。

2 結(jié) 果

2.1 FAPα對(duì) HO-8910PM增殖的影響

為了驗(yàn)證FAPα對(duì)HO-8910PM增殖能力的影響，用FAPα 100和300 pmol/L 2個(gè)濃度在不同的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行增殖試驗(yàn)。結(jié)果在體外加入不同濃度的FAPα，對(duì)卵巢癌細(xì)胞系HO-8910PM均有促增殖作用，并呈劑量依賴性(圖1)。FAPα促進(jìn)HO-8910PM增殖的能力呈時(shí)間依賴性和劑量依賴性，在處理后48 h之內(nèi)作用最明顯(圖2)。

2.2 FAPα對(duì) HO-8910PM遷徙的影響

劃痕實(shí)驗(yàn)檢測FAPα對(duì)HO-8910PM遷徙能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，用FAPα處理后HO-8910PM細(xì)胞的遷徙能力明顯增強(qiáng)，在體外加入不同濃度FAPα的情況下，隨著時(shí)間的推移，并不是藥物濃度越大，癌細(xì)胞遷移速度越快，而是以100 pmol/L組引起的遷移效應(yīng)最為明顯，30 pmol/L組和300 pmol/L組次之。FAPα處理后48 h FAPα100 pmol/L組的劃痕已經(jīng)基本愈合。

2.3 FAPα對(duì) HO-8910PM侵襲的影響

為了檢測FAPα是否能增加HO-8910PM的侵襲能力，常規(guī)接種處于指數(shù)生長期，狀態(tài)良好的卵巢癌細(xì)胞HO-8910PM于Transwell上室，分別加入不同劑量的FAPα使其終濃度為0、30、100和300 pmol/L，進(jìn)行Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)APα增強(qiáng)HO-8910PM的侵襲能力，以終濃度100 pmol/L作用最強(qiáng)(圖4、5)。

3 討 論

卵巢癌的浸潤和轉(zhuǎn)移是造成卵巢癌治療困難死亡率高的主要原因。越來越多的研究證實(shí)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展不是由上皮或間質(zhì)單方面作用所決定的，而是由兩者相互作用所形成的腫瘤-宿主界面微環(huán)境的平衡狀態(tài)來決定，活化的成纖維細(xì)胞即腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(tumor associated fibroblasts，TAF)是腫瘤間質(zhì)的主要成分，對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展起著關(guān)鍵作用［6-9］。

大量的研究都傾向于癌細(xì)胞和間質(zhì)成纖維細(xì)胞通過彼此相互作用而影響細(xì)胞的生長、分化、侵襲和相互調(diào)控［10］。如結(jié)腸癌細(xì)胞可以通過釋放轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)誘導(dǎo)臨近間質(zhì)的成纖維細(xì)胞。成纖維細(xì)胞活化以后，通過分泌大量的細(xì)胞外基質(zhì)成分，如各種生長因子、膠原、蛋白酶和相應(yīng)的抑制物反過來成倍地影響癌細(xì)胞本身［11］，這些變化誘導(dǎo)癌細(xì)胞發(fā)生侵襲前的生長行為［12-13］。腫瘤間質(zhì)的成纖維細(xì)胞表達(dá)多種蛋白酶，能分泌多種基質(zhì)酶如FAP，基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)等，參與基質(zhì)的降解和癌周間質(zhì)的重建，因而與腫瘤細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系。

FAP是活化的成纖維細(xì)胞的標(biāo)志性產(chǎn)物之一，是一種跨膜絲氨酸蛋白酶，具有二肽酶和膠原酶的雙重活性，可以水解基質(zhì)中二肽酶的許多底物、明膠以及Ⅰ型膠原，降解ECM，從而有利于腫瘤細(xì)胞從原發(fā)部位脫離、侵襲和遠(yuǎn)距離轉(zhuǎn)移。通過降解ECM為內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和移動(dòng)創(chuàng)造條件，與肌成纖維細(xì)胞共同參與ECM重建，促進(jìn)腫瘤微血管網(wǎng)的形成，對(duì)腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移及逆轉(zhuǎn)具有重要意義［14］。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)APα能增加HO-8910PM的增殖、侵襲和遷移。

研究FAP在良惡性黑色素細(xì)胞瘤中表達(dá)發(fā)現(xiàn)，受檢的所有黑色素瘤和細(xì)胞痣活化基質(zhì)都可檢測到FAP(+)成纖維細(xì)胞，并且在原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的活化基質(zhì)中可檢測到FAP的表達(dá)上調(diào)，這表明FAP對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長和增殖可能具有調(diào)控作用［15］。另外臨床研究也表明，腫瘤間質(zhì)中FAPα高表達(dá)的結(jié)腸癌患者更容易出現(xiàn)病灶的轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)［16］。在腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移過程伴隨著FAPα的高表達(dá)，說明

FAP在腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要的促進(jìn)作用，其作用機(jī)制尚在研究中。目前科學(xué)界相對(duì)普遍接受的觀點(diǎn)是：FAPα和膜結(jié)合的信號(hào)傳導(dǎo)分子協(xié)同作用，利用FAPα的蛋白酶活性對(duì)信號(hào)分子或其他相關(guān)因子(例如肽類生長因子、趨化因子等)進(jìn)行化學(xué)修飾，調(diào)節(jié)與腫瘤生長相關(guān)的興奮性信號(hào)的傳導(dǎo)。綜上所述，F(xiàn)AP在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用；基于FAPα可作為一種抗腫瘤靶分子，靶位豐富，局部濃度高且無個(gè)體差異性，能夠針對(duì)絕大多數(shù)實(shí)體腫瘤發(fā)揮療效，國外許多研究機(jī)構(gòu)正在努力探究以FAPα為靶標(biāo)的腫瘤靶向治療的策略，并已取得一定成果，國內(nèi)相關(guān)研究也開始起步。

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Biological effect of fi broblast activation protein (FAP) in the proliferation, migration and invasion of ovarian cancer

WEN Qiu-ting, SUN Yu-rong, LI Chun-hong, LIU Hong-yu, BAI Qing-yang(Department of Pathology, Qiqihar Medical University, Qiqihar Heilongjiang 161006,China)

BAI Qing-yang E-mail：blbqy7@sohu.com

Background and purpose：Activated fi broblasts of tumor stroma can express fi broblast activation protein (FAP). The purpose of this research was to study the effect of FAP in the proliferation, migration and invasion of ovarian cancer cellsin vitro.Methods：Human ovarian cancer cell line HO-8910PM was culturedin vitroand was treated with different concentrations of FAP(30, 100 and 300 pmol/L), then examined the function of FAP in the proliferation, migration and invasion of HO-8910PM by the colorimetric MTT Assay, Wound-Healing Assay and Transwell Assay.Results：Colorimetric MTT Assay and the curve of reproduction of cells showed that FAPα could increase HO-8910PM cell proliferation in a duration- and dose-dependent manner; Wound-Healing Assay conf i rmed that FAPα could promote the migration of the ovarian cancer cells, especially the function of 100 pmol/L group (P＜0.01);Transwell Assay certified that FAPα could promote the invasion of the ovarian cancer cells, especially the function of 100 pmol/L group (P＜0.01).Conclusion：FAP may induce the ovarian cancer cells proliferation, invasion and migration.

Fibroblast activation protein; Tumor metastasis; Ovarian cancer cell line HO-8910PM

10.3969/j.issn.1007-3969.2011.06.004

R737.31

A

1007-3639(2011)06-0441-05

柏青楊 E-mail:blbqy7@sohu.com

2011-03-15

2011-05-30）