Med19基因表達變化在骨肉瘤Saos2細胞增殖中的功能研究

杜雪菲 豐濤 何愛娜 劉增軍 湯麗娜 沈贊 姚陽

上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，上海 200233

Med19基因表達變化在骨肉瘤Saos2細胞增殖中的功能研究

杜雪菲 豐濤 何愛娜 劉增軍 湯麗娜 沈贊 姚陽

上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，上海 200233

背景與目的：最近有多項研究表明，Med19基因參與多種腫瘤的形成，如肺癌、乳腺癌和胃癌等。本研究旨在探討Med19基因表達水平的變化對骨肉瘤Saos2細胞株增殖能力和細胞周期的影響。方法：構(gòu)建Med19-siRNA及Med19-OE(overexpression)慢病毒載體感染骨肉瘤Saos2細胞，用real time-PCR驗證Med19基因的沉默效率及過表達效率，MTT法檢測細胞增殖能力，流式細胞儀檢測細胞周期，BALB/c裸鼠移植瘤實驗檢測腫瘤生長情況。結(jié)果：轉(zhuǎn)染Med19-siRNA后細胞增殖能力較陰性對照組顯著降低(P＜0.05)，G0/G1期細胞由(36.93±2.96)%上升至(54.95±2.49)%(P＜0.05)。轉(zhuǎn)染Med19-OE后細胞增殖能力較陰性對照組顯著增加(P＜0.05)，S期細胞由(13.44±0.76)%上升至(16.50±1.67)%(P＜0.05)。BALB/c裸鼠移植瘤實驗顯示，Med19-siRNA組腫瘤體積及體質(zhì)量均較對照組顯著縮小和降低(P＜0.05)。結(jié)論：Med19基因沉默可顯著抑制Saos2細胞體外的增殖能力，并抑制裸鼠Saos2細胞移植瘤的生長，其抑制增殖作用與誘導G0/G1期阻滯有關(guān)。過表達Med19基因可促進Saos2細胞增殖，其促進增殖作用與誘導細胞由G0/G1期向S期過渡有關(guān)。

Med19基因； 慢病毒； 細胞增殖； 周期； 裸鼠

骨肉瘤是青少年常見的惡性骨腫瘤，具有惡性程度高、預后差等特點。目前對骨肉瘤采取的治療手段主要是手術(shù)和化療，但治療效果依然不能令人滿意。靶向基因治療被認為是最佳的治療方法之一，尋找有效的治療靶基因極為重要。Med19在人類編碼的基因名為LCMR1(肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白，Gen Bank編號AANI6075)，是2002年應(yīng)用差異顯示PCR方法從2種不同高低轉(zhuǎn)移潛能的人肺大細胞癌系中克隆到的人類新基因［1］。最近多項研究表明，Med19基因參與多種腫瘤的形成，如肺癌、乳腺癌及胃癌等，提示Med19基因可能參與惡性腫瘤的進程。RNA干擾由Fire發(fā)現(xiàn)并命名，可使目標mRNA特異性降解，稱為基因沉默［2］。相對于以往所用的載體如腺病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒等，慢病毒載體具有可感染非分裂期細胞、容納外源性目的基因的片段大、目的基因表達時間長、不易誘發(fā)宿主免疫反應(yīng)和安全性較好等優(yōu)點［3］。本實驗通過構(gòu)建RNA沉默及過表達慢病毒質(zhì)粒載體調(diào)控骨肉瘤Saos2細胞株Med19基因表達水平，并檢測調(diào)控后細胞生物學行為的改變，探討Med19基因?qū)侨饬鯯ao2細胞增殖和細胞周期的影響，為骨肉瘤的治療提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料和儀器

293T細胞和骨肉瘤Saos2細胞株由中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所提供；dsDNA oligo序列由上海吉凱基因技術(shù)有限公司合成；慢病毒載體系統(tǒng)相關(guān)質(zhì)粒購自Tronolab公司；用于細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)液DMEM和胎牛血清均來自Hyclone公司；熒光顯微鏡購自O(shè)lympus公司；CO2培養(yǎng)箱購自日本三洋公司；流式細胞儀購自美國BD公司；LipofectamineTM2000細胞轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen公司；PCR用引物由上海生工生物工程有限公司合成；real-time PCR試劑盒、DNA分子Marker、限制性內(nèi)切酶、連接酶及其他常規(guī)分子生物學試劑購自TAKARA及NEB公司。BALB/c裸鼠購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司。

1.2 靶向沉默Med19基因的慢病毒載體制備

針對Med19基因序列，設(shè)計RNA干擾靶點序列，合成含干擾序列的dsDNA oligo，其兩端含酶切位點粘端，直接連入酶切并純化后的慢病毒質(zhì)粒載體pGCL-GFP(pGCL-GFP載體含有能持續(xù)表達小RNA的元件，同時能表達熒光蛋白Marker GFP)。將連接好的產(chǎn)物轉(zhuǎn)入制備好的細菌感受態(tài)細胞，對長出的克隆先進行PCR鑒定，在進行測序比對后，鑒定陽性的克隆即為構(gòu)建成功的目的基因RNA沉默慢病毒載體。RNAi慢病毒載體及兩種輔助包裝原件載體質(zhì)粒分別進行高純度無內(nèi)毒素抽提，按Invitrogen公司LipofectamineTM2000使用說明進行共轉(zhuǎn)染293T細胞，12 h后換液，轉(zhuǎn)染48 h收集細胞上清液，并裂解細胞，用微孔濾膜過濾除菌，超速離心后(4 000×g，15 min)棄上清液，用冰PBS溶液重懸病毒沉淀，得到Med19-siRNA慢病毒包裝顆粒，有限稀釋法通過熒光觀察標定病毒滴度。同時設(shè)計陰性對照scrsiRNA(scramble-siRNA)，與任何編碼序列無同源性。

1.3 Med19基因過表達慢病毒載體制備

從cDNA文庫或者含有目的基因的質(zhì)?？寺∧０逯?，利用PCR方法釣取目的基因，將目的基因PCR產(chǎn)物與慢病毒質(zhì)粒載體FUGW分別進行雙酶切。純化酶切產(chǎn)物后進行定向連接或重組，其產(chǎn)物轉(zhuǎn)化細菌感受態(tài)細胞，對長出的克隆先進行PCR鑒定，再對PCR鑒定陽性的克隆進行測序和分析比對，比對正確的即為構(gòu)建成功的融合基因表達質(zhì)粒載體。將構(gòu)建好的融合基因表達載體進行超純?nèi)?nèi)毒素抽提，按Invitrogen公司LipofectamineTM2000使用說明轉(zhuǎn)入293T細胞，收集細胞上清液，過濾后超速離心(條件同上)，濃縮得到Med19過表達慢病毒載體Med19-OE(Med19 overexpression)。同時以慢病毒空載質(zhì)粒FUGW為陰性對照。

1.4 慢病毒質(zhì)粒載體沉默及過表達Med19基因的效率驗證

細胞的融合率約為40%～50%時，用LipofectamineTM2000將慢病毒載體轉(zhuǎn)染入細胞，同時以未經(jīng)任何處理的細胞為空白對照(blank)，以轉(zhuǎn)染含無義序列的慢病毒載體為陰性對照(scr-siRNA/FUGW)，培養(yǎng)72～96 h后在熒光顯微鏡下觀察GFP的表達情況。感染病毒5 d后用TRIzol提取法抽提各組細胞的總RNA，并以此RNA為模板，通過real time-PCR檢測慢病毒感染后細胞中Med19 mRNA表達水平的變化。

1.5 MTT法檢測細胞增殖情況

取對數(shù)生長期的實驗組細胞和陰性對照組細胞接種于96孔板中，Med19基因沉默組計數(shù)細胞每孔2 000個，Med19基因過表達組計數(shù)細胞每孔1 000個，每組平行設(shè)5個復孔。放進細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)終止前4 h加入10 μL 5 mg/mL MTT于孔中，無需換液。4 h后完全吸去培養(yǎng)液后加100 μL DMSO終止反應(yīng)。酶標儀于570 nm處檢測吸光度(D)值，根據(jù)D570值繪制細胞生長曲線。

1. 6 細胞周期檢測

收集轉(zhuǎn)染后擴增的實驗組細胞和陰性對照組細胞，消化細胞，使細胞完全單個分離，1 500 r/min，r=10 cm離心5 min收集細胞，預冷的PBS洗滌細胞沉淀2次，PBS重懸后漩渦振蕩器震蕩中，滴入預冷70%乙醇，4 ℃固定過夜。PBS洗滌細胞1次，根據(jù)細胞數(shù)加入一定體積的細胞染色液(細胞染色液配制：40×PI母液∶100×RNase母液∶1×PBS =25∶10∶1 000)重懸，避光30 min后篩網(wǎng)過濾于流式上機管中檢測。

1.7 BALB/c裸鼠移植瘤實驗

選取4～6周齡BALB/c裸鼠，雄性，分3組，每組6只。收集空白對照組，scr-siRNA組及Med19-siRNA組3株細胞，用無血清的DMEM培養(yǎng)液制成2×107mL-1細胞懸液，用1 mL注射器(用6號針頭)吸取0.2 mL接種于BALB/c裸小鼠右背側(cè)皮下(4×106個細胞/只)，每株細胞分別接種6只動物，接種后的動物在SPF級動物房中飼養(yǎng)。自移植瘤形成后每3 d測量腫瘤大小，共觀察15 d。觀察結(jié)束后處死動物，稱瘤體體質(zhì)量并計算腫瘤體積。

1.8 統(tǒng)計學處理

應(yīng)用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，統(tǒng)計方法采用t檢驗和單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2. 1 慢病毒質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染Saos2細胞

經(jīng)鑒定確認載體組建成功后，分別轉(zhuǎn)染入骨肉瘤Saos2細胞，質(zhì)粒攜帶有GFP綠色熒光蛋白基因，熒光顯微鏡下，轉(zhuǎn)染成功的細胞可見綠色熒光，鏡下觀察基因沉默陰性對照組scrsiRNA、實驗組Med19-siRNA細胞及基因過表達陰性對照組FUGW、實驗組Med19-OE細胞，約80%的細胞轉(zhuǎn)染成功(圖1)。

2.2 沉默及過表達Med19基因效率驗證

轉(zhuǎn)染Med19-siRNA對Saos2細胞Med19 mRNA表達的影響通過real time-PCR實驗結(jié)果顯示，Med19-siRNA組的Med19 mRNA表達與空白對照組及scr-siRNA組比較均明顯降低(P＜0.05)，Med19基因沉默率約為82%，而空白對照組與scr-siRNA組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05，表1)。轉(zhuǎn)染Med19-OE對Saos2細胞Med19 mRNA表達的影響通過real time-PCR實驗結(jié)果顯示，Med19-OE組的Med19 mRNA表達與blank組及FUGW組比較均明顯升高(P＜0.05)，Med19基因過表達倍數(shù)約為28.7倍，而blank組與FUGW組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05，表2)。

表 1 轉(zhuǎn)染Med19-siRNA對Saos2細胞Med19 mRNA表達的影響Tab. 1 The expression of Med19 mRNA in Saos2 cells transfected with Med19-siRNA detected by real-time PCR analysis(n=3, ±s)

表 1 轉(zhuǎn)染Med19-siRNA對Saos2細胞Med19 mRNA表達的影響Tab. 1 The expression of Med19 mRNA in Saos2 cells transfected with Med19-siRNA detected by real-time PCR analysis(n=3, ±s)

: Compared with scr-siRNA and blank, P＜0.05.

Group ΔCt 2-ΔΔCt Med19 mRNA relative level Blank 8.87±0.03 1.00±0.02 1.0 scr-siRNA 8.98±0.01 0.93±0.01 0.93 Med19-siRNA 11.31±0.14 0.18±0.02 0.18*

*

表 2 轉(zhuǎn)染Med19-OE對Saos2細胞Med19 mRNA表達的影響Tab. 2 The expression of Med19 mRNA in Saos2 cells transfected with Med19-OE detected by real-time PCR analysis(n=3, ±s)

表 2 轉(zhuǎn)染Med19-OE對Saos2細胞Med19 mRNA表達的影響Tab. 2 The expression of Med19 mRNA in Saos2 cells transfected with Med19-OE detected by real-time PCR analysis(n=3, ±s)

*: Compared with FUGW and blank, P＜0.05.

2.3 MTT法測定Saos2細胞增殖情況

根據(jù)連續(xù)5 d測定的實驗組和陰性對照組細胞D值，繪制細胞生長曲線，并對數(shù)值進行統(tǒng)計學分析，發(fā)現(xiàn)沉默Med19基因可以明顯抑制Saos2細胞的增殖。Med19-siRNA組細胞D值在第2天為0.10±0.01，而scr-siRNA組則升高至0.34±0.03，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，第3～5天Med19-siRNA組D值與scr-siRNA組比較，差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，圖2A)。過表達Med19基因，可以明顯促進Saos2細胞的增殖。FUGW組細胞D值在第2天為0.16±0.02，而Med19-OE組則升高至0.33±0.02，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，第3～5天Med19-OE組D值與FUGW組比較，差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，圖2B)。

2.4 流式細胞儀檢測細胞周期

流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，Med19-siRNA轉(zhuǎn)染后與scr-siRNA組比較，G0/G1期細胞比例由(36.93±2.96)%上升至(54.95±2.49)%(P＜0.05)，S期細胞比例由(17.49±1.45)%下降至(13.80±1.13)%(P＜0.05)，G2/M期細胞比例由(30.87±2.64)%下降至(20.02±1.12)% (P＜0.05，圖3A)。Med19-OE轉(zhuǎn)染后與FUGW組比較，G0/G1期的細胞比例由(50.10±1.42)%下降至(40.64±1.47)%(P＜0.05)，S期細胞比例由(13.44±0.76)%上升至(16.50±1.67)%(P＜0.05)，G2/M期細胞比例變化差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05，圖3B) 。

2.5 BALB/c裸鼠移植瘤實驗結(jié)果

3組裸鼠移植部位皮下均出現(xiàn)移植瘤，成瘤率為100%(圖4)。Med19-siRNA組移植瘤體積自成瘤后第5天為(32.41±4.70) mm3，與空白對照組［(137.83±22.62) mm3］及scrsiRNA組［(133.79±20.73) mm3］比較顯著縮小(P＜0.05)，第8、12和15天Med19-siRNA組移植瘤體積與空白對照組及scr-siRNA組比較均顯著縮小(P＜0.05)，scr-siRNA組與空白對照組移植瘤體積差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。觀察15 d后處死裸鼠稱重，Med19-siRNA組移植瘤體質(zhì)量為(0.040±0.006)g，與空白對照組［(0.250±0.062)g］及scr-siRNA組［(0.200±0.015)g］比較顯著降低(P＜0.05)，scr-siRNA組與空白組移植瘤體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05，表3)。

表 3 各組裸鼠移植瘤體積及體質(zhì)量變化Tab. 3 Volume and weight of transplanted tumors in BALB/c nude mice(n=6, ±s)

表 3 各組裸鼠移植瘤體積及體質(zhì)量變化Tab. 3 Volume and weight of transplanted tumors in BALB/c nude mice(n=6, ±s)

*: Compared with scr-siRNA and blank, P＜0.05.

Group Tumor weight/g 5 d 8 d 12 d 15 d Tumor volume/mm3 Blank 137.83±22.62 258.04±31.05 404.17±28.35 582.85±72.41 0.25±0.062 scr-siRNA 133.79±20.73 167.41±19.91 300.21±33.03 525.81±60.63 0.20±0.015 Med19-siRNA 32.41±4.70* 58.44±7.96* 95.83±6.85* 140.80±16.24* 0.04±0.006*

3 討 論

Med19基因位于染色體的11q12.1位置，編碼一種與酵母中促進轉(zhuǎn)錄的中介因子復合體(mediator 19，Med19)同源的蛋白。中介因子復合體蛋白(mediator)最早在酵母中發(fā)現(xiàn)，由25個亞基組成的復合體，其可以與RNA聚合酶Ⅱ結(jié)合，促進或抑制mRNA的合成，結(jié)構(gòu)上分為頭部、中部和尾部，其中頭部和尾部對中介因子復合體的活性起決定作用［4-5］。最近的研究表明，哺乳動物和酵母的中介因子復合體在亞基組成、結(jié)構(gòu)、功能等方面有非常強的保守性［6］。酵母的Med19有調(diào)節(jié)中介因子復合體頭部和尾部組件的各亞基之間連接的作用，在復合體行使功能中發(fā)揮重要作用［7］。實驗表明，缺乏Medl9時中介因子復合體盡管保留了共刺激活性，但是與RNA聚合酶Ⅱ的結(jié)合能力降低，并且不能通過TFIIH使RNA聚合酶U的CTD磷酸化。在研究中發(fā)現(xiàn)缺乏Med19的中部組件可以與RNA聚合酶Ⅱ結(jié)合，只是不能單獨、直接與其結(jié)合。所以突變的Med與聚合酶結(jié)合對轉(zhuǎn)錄有影響，并由于構(gòu)象的不穩(wěn)定引起活化和抑制的雙重作用［8］。哺乳動物的Med19同樣在調(diào)節(jié)基因表達方面發(fā)揮重要作用，如Med19可以和RE1轉(zhuǎn)錄沉默子直接結(jié)合，抑制神經(jīng)相關(guān)基因在非神經(jīng)細胞中的表達［9］。

人體內(nèi)Med19已經(jīng)定義被為腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因，可直接或間接參與、介導腫瘤細胞的多種信號途徑。李金東等［10］構(gòu)建siRNA-Med19慢病毒表達載體，利用RNAi技術(shù)沉默肺癌細胞中Med19基因，可誘導腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤細胞生長。丁相福等［11］利用沉默胃癌MGC-803細胞Med19基因，發(fā)現(xiàn)細胞增殖能力顯著降低、細胞克隆形成能力明顯減弱。Li等［12］在乳腺癌組織中用免疫組織化學分析檢測，發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織高表達Med19，并且Med19的表達與腫瘤分級顯著相關(guān)，并證明Med19在人類乳腺癌細胞增殖中起著重要作用。

本研究主要通過構(gòu)建Med19基因沉默及過表達慢病毒質(zhì)粒載體的方法對骨肉瘤Saos2細胞株的Med19基因進行調(diào)控，獲得了有效的Med19-siRNA及Med19-OE包裝病毒，感染Saos2細胞后其mRNA沉默率約為82%，過表達率約為28.7倍。表明應(yīng)用Med19-siRNA可成功沉默Med19基因，Med19-OE可以成功使Med19基因過表達。同時本研究還發(fā)現(xiàn)Med19基因的沉默可顯著抑制骨肉瘤Saos2細胞的增殖速度，也可以影響細胞周期，使處于G0/G1期的細胞比例增加，處于S期及G2/M期的細胞比例下降。提示沉默Med19基因抑制Saos2細胞增殖作用與誘導G0/G1期阻滯有關(guān)。Med19基因過表達可顯著提高骨肉瘤Sao2細胞的增殖速度，也可以影響細胞周期，使處于G0/G1期的細胞比例下降，處于S期的細胞比例增加。提示過表達Med19基因促進Saos2細胞增殖作用與誘導細胞由G0/G1期向S期過渡有關(guān)。通過BALB/c裸鼠移植瘤實驗發(fā)現(xiàn)，沉默Med19基因后，Saos2細胞移植瘤的體積和質(zhì)量都與對照組有顯著差異。進一步證明抑制Med19基因的表達可以有效抑制裸鼠骨肉瘤Saos2細胞移植瘤的生長。今后在骨肉瘤治療中，以Med19基因為靶點，利用siRNA技術(shù)進行基因治療將可能成為一種新的治療手段。同時也將為后續(xù)研究Med19基因在骨肉瘤中的作用機制和臨床研究打下了基礎(chǔ)。

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Research on function ofMed19gene expression in Saos2 cell’s proliferation

DU Xue-fei，F(xiàn)ENG Tao，HE Ai-na，LIU Zeng-jun，TANG Li-na，SHEN Zan，YAO Yang(Department of Oncology，the Sixth People Hospital，Medical College of Shanghai Jiao Tong University，Shanghai 200233, China)

YAO Yang E-mail：sshenzzan@gmail.com

Background and purpose：Recently, humanMed19was reported to participate in the carcinogenesis of breast cancer, lung cancer and gastric cancer etc. This study was to investigate the effect ofMed19gene on the proliferation rate and cell cycle of Saos2 osteosarcoma cell.Methods：Med19-siRNA and Med19-OE(overexpression) lentivirus vectors were constructed and then used to transfect the Saos2 osteosarcoma cells. Real time-PCR was employed to assess the gene silencing and overexpression efficacy of these recombinants. The cell proliferation and cell cycle were tested by using MTT and fl ow cytometry respectively. BALB/c nude mice-transplanted tumors were used to estimate the tumor growth rates.Results：After Med19-siRNA transfection, the cell proliferation rate was significantly lower compared that of the control group (P＜0.05). Simultaneously, the proportion of G0/G1cells increased from (36.93±2.96)% to (54.95±2.49)% (P＜0.05). On the contrary, after Med19-OE transfection, the cell proliferation rate was significantly higher than that of the control group (P＜0.05), and the proportion of S cells increased from (13.44±0.76)% to (16.50±1.67)% (P＜0.05). The tumor volume and weight test showed that the transplanted tumor growth rate of Med19-siRNA group was significantly slower than that of the blank and negative control groups (P＜0.05).Conclusion：Silencing ofMed19gene could significantly inhibit the proliferation rate of Saos2 cell and transplanted tumor growth rate. The inhibitory effect may result from the G0/Glcycle block. While the overexpression ofMed19gene results in the opposite effects.

Med19gene; Lentivirus; Proliferation; Cell cycle; Nude mice

10.3969/j.issn.1007-3969.2011.06.003

R738.1

A

1007-3639(2011)06-0435-06

上海市科學技術(shù)委員會科研計劃項目(No：09140902200)；上海市浦江人才計劃(No：10PJ1408300)。

姚陽 E-mail:sshenzzan@gmail.com

2011-01-20

2011-05-18）