消銀解毒飲調(diào)控銀屑病血熱證腫瘤壞死因子-α的相關(guān)研究

夏夢，段行武，高永紅，張潤田，郝峰

（北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京 100700）

銀屑病是一種常見的慢性炎癥性皮膚病，臨床以各種形態(tài)的紅斑鱗屑為特征，其病理特點是表皮角質(zhì)形成細胞的過度增殖、分化不全以及真皮毛細血管的增生。目前許多學(xué)者認為銀屑病是一種多基因遺傳背景下的T細胞性的自身免疫性疾病[1]，發(fā)病機制的關(guān)鍵是T細胞活化，由活化T細胞產(chǎn)生的淋巴因子刺激表皮增殖，而增殖角質(zhì)形成細胞又釋放其他細胞因子增強活化T細胞作用，形成T細胞介導(dǎo)的惡性循環(huán)。

消銀解毒飲為我院院內(nèi)制劑，在臨床已應(yīng)用了二十余年，臨床療效滿意[2]，為揭示其對銀屑病的調(diào)控作用機制，本研究擬以人HaCat細胞和人外周血單一核細胞（PBMCs）為研究對象；用四唑鹽比色法觀察消銀解毒飲及其拆方后兩組藥物（解毒方和涼血方）血清對其增殖的影響；用雙抗體夾心法測定藥物對混合培養(yǎng)細胞分泌細胞因子腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的影響。研究該方治療銀屑病的細胞分子機制，為中藥辨證組方治療銀屑病提供臨床依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 人永生化角質(zhì)形成細胞株HaCat細胞，引自中國武漢大學(xué)，中國典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.1.2 人PBMCs來源 銀屑病血熱證患者PBMCs來自2009年7月—2010年3月東直門醫(yī)院皮膚科門診銀屑病初診患者，共20例，其中男11例，女9例，年齡最大57歲，最小26歲，年齡均45.6歲；病程最長10年，最短3個月，平均病程5.6年。

1.1．3 研究對象的確定

1.1.3.1 診斷標(biāo)準 根據(jù)文獻[3]診斷標(biāo)準.，年齡在18～65歲的銀屑病患者。納入標(biāo)準：1個月內(nèi)無任何發(fā)熱史；3個月內(nèi)未接受任何系統(tǒng)治療，如糖皮質(zhì)激素、維A酸類和免疫抑制劑等；3個月內(nèi)未大面積外用強效糖皮質(zhì)激素類藥物。

1.1.3.2 辨證標(biāo)準 根據(jù)文獻[4]辨證標(biāo)準，皮疹不斷增多，顏色鮮紅，層層脫屑，有點狀出血現(xiàn)象；伴有口干舌燥，咽喉疼痛，心煩易怒，大便干燥，小便赤黃；舌質(zhì)紅，苔薄黃，脈滑或數(shù)。

1.1.3.3 排除標(biāo)準 不符合診斷標(biāo)準，不符合血熱證辨證標(biāo)準；合并有其他重要臟器疾病者；妊娠或哺乳期婦女、精神病患者等。

1.1.4 實驗動物 SD大鼠，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，在北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院三級動物實驗室屏障使用環(huán)境中進行實驗。

1.1.5 試劑 四唑鹽(MTT)和二甲基亞砜(DMSO)，Amresco公司；TNF-α-Elisa試劑盒,Raybiotech公司；陽性對照藥甲氨蝶呤（MTX），上海醫(yī)藥（集團）有限公司信誼制藥總廠。

1.2 方法

1.2.1 中藥提取液的制備 消銀解毒飲、涼血方、解毒方濃縮液均由東直門醫(yī)院藥理實驗室加工完成。消銀解毒飲為每mL含3g生藥；涼血方為每mL含1.35g生藥；解毒方為每mL含2.1g生藥。

1.2.2 動物藥物血清制備 取50只清潔大鼠隨機分為5組，消銀解毒飲組、涼血方組、解毒方組、甲氨蝶呤（MTX）陽性對照組及蒸餾水空白對照組，每組10只。3個中藥組分別給予相應(yīng)的中藥提取液灌胃（按照人和動物體表面積折算成人2倍的劑量），用量分別為消銀解毒飲22.5g（/kg·d），涼血方10.125g（/kg·d）；解毒方15.75g（/kg·d）；MTX組以蒸餾水溶解液灌胃，用量為0.45mg/(kg·d)；蒸餾水組給予等量蒸餾水灌飼，2次/d，連續(xù)7d后，腹主動脈取血，分離血清，滅活分裝備用。

1.2.3 人PBMCs的分離、培養(yǎng) PBMCs即外周血中具有單一核的細胞，包括淋巴細胞和單核細胞。分離方法為Ficoll-Hypaque（葡聚糖－泛影葡氨）密度梯度離心法。

1.2.4 人HaCat細胞與人PBMCs混合接種及培養(yǎng) 以完全培養(yǎng)液將對數(shù)生長期的人永生化角質(zhì)形成細胞株HaCat細胞調(diào)成5×107/L，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100μL，再以每孔7 000個加入銀屑病血熱證患者PBMCs，采用含10%胎牛血清,100U/mL的青、鏈霉素的MEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱混合培養(yǎng)。

1.2.5 四唑鹽（MTT）比色實驗測定角質(zhì)形成細胞增殖率 混合培養(yǎng)細胞24h后，顯微鏡下觀察細胞生長良好，小心配平，1 000r/min離心5min，吸去舊培養(yǎng)液，每孔分別加入體積分數(shù)為2.5%、5%、7.5%的藥理血清100μL（每組設(shè)9個復(fù)孔），并設(shè)蒸餾水組為空白對照組，MTX組為陽性對照組，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱混合培養(yǎng)48h后，吸棄孔內(nèi)液體，每孔加入無血清MEM 100μL和 5g/L的 MTT 20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，吸棄孔內(nèi)液體，每孔加入DMSO 150μL，震蕩10min，待結(jié)晶物充分溶解，用酶標(biāo)儀檢測492nm處的吸光度值（A值）。

1.2.6 雙抗體夾心法測定細胞培養(yǎng)上清TNF-α含量 取混合培養(yǎng)HaCat細胞與PBMCs細胞48h細胞上清液，采用雙抗體夾心法，嚴格按照說明書操作。

1.3 統(tǒng)計方法 分析組間差別，結(jié)果以x±s表示，SPSS 16．0軟件統(tǒng)計分析軟件One-Way ANVOVA過程進行方差分析，P<0.05表示差別有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 藥物對人永生化角質(zhì)細胞增殖的影響 消銀解毒飲能抑制銀屑病血熱證患者角質(zhì)形成細胞的增殖，，當(dāng)濃度達到5%時有極其顯著性差異，與生理鹽水組比較有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001），藥理血清的體積與角質(zhì)細胞增殖呈負相關(guān)。消銀解毒飲組療效優(yōu)于其他兩組中藥，有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)果見表1（用細胞存活率%來表示）。

細胞存活率（%）=不同動物藥物血清組A值/蒸餾水組A值×100%。

2.2 細胞形態(tài)學(xué)觀察 在混合細胞培養(yǎng)板中加入藥理血清作用48 h后，藥理血清各劑量組在光鏡下均可觀察到其中的貼壁細胞HaCat細胞的生長受到不同程度的抑制，單位面積數(shù)目減少、細胞變圓、變小、漂浮。

2.3 藥物對混合細胞上清TNF-α的影響 消銀解毒飲能抑制分泌細胞因子TNF-α，與蒸餾水組比較有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。且消銀解毒方效果優(yōu)于涼血方、解毒方兩組，有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）。見表2。

表1 不同體積分數(shù)藥理血清對角質(zhì)細胞生長增殖的影響（±s）

表1 不同體積分數(shù)藥理血清對角質(zhì)細胞生長增殖的影響（±s）

注：各組與蒸餾水組相比,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001；涼血方、解毒方與消銀解毒方相比，☆P<0.05。

2.5%藥理血清 5%藥理血清 7.5%藥理血清n 66666組別蒸餾水組涼血方組解毒方組消銀解毒組甲氨蝶呤組FP A值0.512±0.023 0.438±0.030*☆0.418±0.035**☆0.416±0.038**0.403±0.007**6.886 0.006細胞存活率(%)100 85.4±2.0 81.6±2.6 81.3±6.7 78.7±2.4 A值0.517±0.009 0.434±0.003***☆0.410±0.037***☆0.408±0.04***0.375±0.006***25.846 0.000細胞存活率(%)100 83.9±0.1 79.3±5.6 78.9±0.2 72.5±0.1 A值0.539±0.028 0.433±0.007***☆0.408±0.006***☆0.392±0.031***0.368±0.019***32.339 0.000細胞存活率(%)100 80.3±2.8 75.7±0.5 72.7±2.7 68.3±0.12

表2 不同體積分數(shù)藥理血清對混合細胞培養(yǎng)上清TNF-α的影響（±s）

表2 不同體積分數(shù)藥理血清對混合細胞培養(yǎng)上清TNF-α的影響（±s）

注：各組與蒸餾水組相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；涼血方、解毒方與消銀解毒飲相比，☆P<0.05。

TNF-α n 66666組別蒸餾水組涼血方組解毒方組消銀解毒組甲氨蝶呤組FP 5%藥理血清13.716±4.355 11.639±1.244 9.563±3.110 7.083±3.730*4.909±2.432*2.936 0.076 7%藥理血清22.440±4.940 10.336±3.384**☆9.621±3.390**☆5.306±4.432***4.524±3.889***14.742 0.000 2.5%藥理血清13.300±4.355 11.636±0.620 8.737±2.490 7.91±4.970 4.492±1.857*3.005 0.072

3 討論

銀屑病是一種炎癥增生性皮膚病，皮損的真皮層有活化的T細胞浸潤，這些T細胞可以通過多種途徑與表皮細胞產(chǎn)生相互作用，如分泌細胞因子、激活表皮細胞的增殖及凋亡通道，影響環(huán)核苷酸及酶學(xué)的水平等。真皮層浸潤的T細胞誘導(dǎo)表皮細胞合成TNF-α等細胞因子，吸引中性粒細胞在表皮浸潤，導(dǎo)致真皮血管擴張，引起皮膚炎癥[5]。

目前銀屑病的發(fā)病機制雖然尚未完全明了，但在銀屑病的發(fā)病機制中起核心作用的是T淋巴細胞的免疫異常和某些細胞因子的釋放，許多具有多種免疫學(xué)活性的細胞因子如TNF-α、干擾素（IFN）-γ等參與銀屑病病理相關(guān)的免疫過程，引起T淋巴細胞和中性粒細胞的活化及趨化。TNF-α主要由活化的單核/巨噬細胞產(chǎn)生，能殺傷和抑制腫瘤細胞，促進中性粒細胞吞噬，抗感染，引起發(fā)熱，促進細胞增殖和分化是重要的炎癥因子，并參與某些自身免疫病的病理損傷。銀屑病患者血清中TNF-α呈高水平表達，受TNF-α刺激后T細胞的增生活性及分泌白介素（IL）-8的活性顯著增強，提示T細胞在外周血中已處于明顯活化狀態(tài)[6]。TNF-α通過活化T細胞，增強T細胞浸潤及增加銀屑病皮損中角質(zhì)形成細胞增生來影響銀屑病發(fā)病[7]，銀屑病患者外周血淋巴細胞具有促進自身角質(zhì)形成細胞生長的作用[8]，導(dǎo)致角質(zhì)形成細胞過度增殖。

中醫(yī)對銀屑病的病因病機的認識以圍繞血熱、血瘀、血燥、血虛的學(xué)說為主，認為血熱是銀屑病的主要原因，因此清熱涼血是治療銀屑病的基本方法。全方由水牛角、牡丹皮、赤芍、生甘草、白鮮皮、苦參等組成，方中水牛角涼血解毒為君藥；牡丹皮、赤芍等加強涼血解毒之力為臣藥；白鮮皮、苦參等祛風(fēng)除濕為佐藥；甘草解毒調(diào)和諸藥為使藥；全方共起涼血解毒、祛風(fēng)除濕之功效。涼血方和解毒方均為消銀解毒飲的拆方中藥組，其中涼血方以涼血類中藥為主，解毒方以解毒類中藥為主。瞿幸[2]用消銀解毒飲治療銀屑病血熱證85例，療程8周，總有效率91.8%；對照組30例服用復(fù)方青黛膠囊，總有效率80%。治療組明顯優(yōu)于對照組。

本實驗結(jié)果證實，消銀解毒飲可以抑制人永生化角質(zhì)形成細胞的活化增殖，當(dāng)濃度達到5%時有極其顯著性差異（P＜0.001），也可以抑制人混合細胞分泌細胞因子TNF-α（P<0.05），且效果優(yōu)于其他兩組拆方中藥組。因此，消銀解毒飲能夠有效的治療血熱證型銀屑病，中藥涼血類藥物與解毒類藥物均對血熱證型銀屑病有治療效果，但兩組藥物的協(xié)同作用可使治療效果加倍。因此我們推理消銀解毒飲可能是通過抑制銀屑病某些細胞因子TNF-α來抑制T細胞活化，由此調(diào)控活化T細胞產(chǎn)生的某些淋巴因子來抑制表皮增殖，而抑制增殖角質(zhì)形成細胞又可以反過來調(diào)控釋放某些細胞因子來減弱活化T細胞的作用，從而打破T細胞介導(dǎo)的惡性循環(huán)來達到抑制角質(zhì)細胞過度增殖和活化的作用。

本課題通過體外細胞培養(yǎng)的方法研究了中藥復(fù)方對銀屑病角質(zhì)細胞過度增殖和混合細胞分泌細胞因子TNF-α的影響，為臨床運用消銀解毒飲治療銀屑病和中藥對銀屑病發(fā)揮治療作用機理提供了一定的理論依據(jù)。

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