結(jié)核病患者血清中Small RNAs表達(dá)譜分析

鐘球 周琳 錢(qián)明 陳濤 陳亮 李海成

(廣東省結(jié)核病防治研究所 廣州 510630)

結(jié)核病患者血清中Small RNAs表達(dá)譜分析

鐘球 周琳 錢(qián)明 陳濤 陳亮 李海成

(廣東省結(jié)核病防治研究所 廣州 510630)

目的了解結(jié)核病患者血清中Small RNA(sRNA)表達(dá)譜的特征,為從Small RNA角度探討結(jié)核病發(fā)生、發(fā)展的調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)>。方法采用Solexa深度測(cè)序技術(shù)得到包括miRNA、siRNA 、piRNA 、rRNA 、tRNA 、snRNA 、snoRNA 、repeat associate sRNA 、exon 或 intron 降解片段等在內(nèi)的所有Small RNA。通過(guò)與已知數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)、尋找樣品與數(shù)據(jù)庫(kù)之間在基因組位置上的overlap等方法,對(duì)sRNA進(jìn)行注釋,同時(shí)選取沒(méi)有被注釋上的 sRNA,使用華大自主開(kāi)發(fā)的軟件Mireap預(yù)測(cè)novel miRNA>。結(jié)果非結(jié)核病組血清中發(fā)現(xiàn)109 630種、2 759 795條Small RNA,其中候選miRNA種數(shù)為84、候選miRNA總表達(dá)量為1 433;結(jié)核病組血清中發(fā)現(xiàn)97614種、1 452119條Small RNA,其中候選miRNA種數(shù)為65、候選miRNA總表達(dá)量為755>。結(jié)論結(jié)核病人與非結(jié)核病人血清中的Small RNA表達(dá)譜存在種類與數(shù)量上的差異。

結(jié)核/血液;微 RNAs;基因表達(dá)

Small RNA是生物體內(nèi)一類重要的特殊分子,在生物進(jìn)化過(guò)程中高度保守。他可以誘導(dǎo)基因沉默,參與細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、基因轉(zhuǎn)錄和翻譯等諸多生命活動(dòng)的調(diào)控過(guò)程,并已被證實(shí)參與和調(diào)控包括時(shí)序發(fā)育、細(xì)胞凋亡、神經(jīng)元發(fā)育、激素分泌等在內(nèi)的多種生理過(guò)程[1]。Micro RNA(miRNA)是目前研究最為廣泛的一類內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA,長(zhǎng)度在22 nt左右[2-3],進(jìn)化上高度保守。是真核生物基因表達(dá)中的一類負(fù)調(diào)控因子,通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則與靶基因mRNA結(jié)合,在轉(zhuǎn)錄后水平上使基因沉默,從而使mRNA降解或抑制mRNA翻譯[4],也能在轉(zhuǎn)錄水平上通過(guò)決定目標(biāo)基因染色體位點(diǎn)的甲基化而起作用。

檢測(cè)周期長(zhǎng)、高耐藥率是結(jié)核病醫(yī)務(wù)工作者面臨的兩大挑戰(zhàn)。鑒于血清學(xué)診斷的簡(jiǎn)便、快速以及其在許多傳染病診斷中所發(fā)揮的重要診斷作用,血清學(xué)診斷始終是結(jié)核病免疫學(xué)關(guān)注的焦點(diǎn)。但由于體液免疫與結(jié)核病發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)歸的相關(guān)性仍不明晰,目前針對(duì)結(jié)核分枝桿菌各種抗原的抗體檢測(cè)臨床價(jià)值受限[5-6]。另辟蹊徑尋找結(jié)核病血清學(xué)診斷標(biāo)志物是當(dāng)今熱門(mén)課題之一?；赟olexa高通量測(cè)序技術(shù)的小 RNA數(shù)字化分析,采用邊合成邊測(cè)序(SBS-sequencing by synthesis),可減少因二級(jí)結(jié)構(gòu)造成的一段區(qū)域的缺失。并具有所需樣品量少,高通量,高精確性,擁有簡(jiǎn)單易操作的自動(dòng)化平臺(tái)和功能強(qiáng)大等特點(diǎn),一次性獲得數(shù)百萬(wàn)條小分子RNA序列,能夠快速全面地鑒定該物種在該狀態(tài)下的小分子RNA和發(fā)現(xiàn)新的小分子RNA,構(gòu)建樣品之間的小分子RNA差異表達(dá)譜。本文利用Solexa高通量測(cè)序技術(shù),分析非結(jié)核病組和結(jié)核病組血清中Small RNA表達(dá)譜的差異。為從血清Small RNA這個(gè)角度對(duì)結(jié)核病的發(fā)生、發(fā)展;耐藥結(jié)核病的發(fā)生機(jī)制;結(jié)核分枝桿菌與機(jī)體的相互作用等方面進(jìn)行研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 樣本來(lái)源 27例涂陽(yáng)肺結(jié)核患者(下稱“結(jié)核病組”,包括：男19例、女8例,年齡在 22～87歲之間,平均42歲)血清由廣州市胸科醫(yī)院提供,25例健康志愿者血清取自本單位職工(下稱“非結(jié)核病組”,包括：男 11例、女 14例,年齡在 25～50歲之間,平均34歲)。

1.1.2 樣本采集和保存 抽取靜脈血4～5 ml置于2支真空促凝管中,室溫靜置約30 min,4 000轉(zhuǎn)/min離心5 min,吸取血清均分至2支2 ml低溫凍存管中,-70℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 試劑與儀器 一次性真空促凝管購(gòu)自廣州陽(yáng)普醫(yī)療科技股份有限公司;Total RNA Purification Kit(T RK-1001)為美國(guó)LC Sciences公司產(chǎn)品;從總RNA中分離sRNA、RT-PCR擴(kuò)增、cDNA樣品準(zhǔn)備、DNA成簇?cái)U(kuò)增及測(cè)序等試劑使用Illumina公司配套產(chǎn)品;序列測(cè)定應(yīng)用Illumina HiSeqTM 2000測(cè)序儀系統(tǒng)。

1.2 方法

1.2.1 血清總RNA提取 從-70℃冰箱取出每例備用血清樣本1支,置室溫待其溶解;從病例組、對(duì)照組的樣本中各取1 ml血清按組別分別加至2支50 ml離心管中,制備病例組、對(duì)照組混合血清各1管;嚴(yán)格按LC Sciences RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取血清總RNA。

1.2.2 血清Small RNA測(cè)序 血清sRNA分離、純化、cDNA文庫(kù)建立、擴(kuò)增與測(cè)序、生物信息學(xué)分析由深圳華大基因研究院協(xié)助完成,實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照試劑和儀器說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。主要實(shí)驗(yàn)流程包括：從總RNA中分離sRNA→5′接頭連接→3′接頭連接→RT-PCR擴(kuò)增→sRNA文庫(kù)的純化→文庫(kù)的檢測(cè)→DNA在Cluster Station成簇?cái)U(kuò)增→Illumina HiSeqTM 2000測(cè)序儀上的測(cè)序→對(duì)10～30nt sRNA干凈序列采用GenomeStudio軟件進(jìn)行生物信息學(xué)分析,得到兩種人群血清中Small RNA的表達(dá)譜。

2 結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)質(zhì)量及長(zhǎng)度分析 非結(jié)核病組,有11 059 438條Small RNA序列被測(cè)定,其中高質(zhì)量測(cè)序片斷10 639 162條。將高質(zhì)量的測(cè)序片段去接頭、去污染后得到干凈序列2 759 795條。結(jié)核病組,有10 174 571條Small RNA序列被測(cè)定,其中高質(zhì)量測(cè)序片斷9 732 428條。將高質(zhì)量的測(cè)序片段去接頭、去污染后得到干凈序列1 452 119條。然后對(duì)干凈序列的各種血清Small RNA進(jìn)行表達(dá)分析,一般來(lái)說(shuō),Small RNA的長(zhǎng)度區(qū)間為18～30nt,長(zhǎng)度分布的峰能幫助我們判斷Small RNA的種類,如miRNA集中在21或22nt,siRNA集中在24nt,piRNA集中在30 nt。2組人群血清中10～30nt的Small RNA的表達(dá)豐度見(jiàn)表1,其分布譜型見(jiàn)圖1。

表1 不同長(zhǎng)度(nt)血清Small RNA的表達(dá)豐度(%)

圖1 2組人群血清中不同長(zhǎng)度Small RNA的表達(dá)譜型圖

表2 非結(jié)核病組血清中Small RNA在各類中的分布

2.2 Small RNA分類注釋 將所有Small RNA與各類RNA的比對(duì)、注釋情況進(jìn)行總結(jié)。在以上各注釋信息中,有可能存在一個(gè)Small RNA同時(shí)比對(duì)上2種不同的注釋信息的情況。為了使每種Small RNA有唯一的注釋,按照rRNAetc＞known miRNA＞repeat＞exon＞intron的優(yōu)先級(jí)順序?qū)mall RNA遍歷,沒(méi)有比上任何注釋信息的Small RNA用unann表示。由于 rRNAetc是由 NCBI Genbank和Rfam 2個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)所得,規(guī)定這2個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)間的優(yōu)先級(jí)為Genbank＞Rfam[7]。分類注釋結(jié)果中的rRNA總量可以作為一個(gè)樣品的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)：一般情況下質(zhì)量較好的動(dòng)物樣品中rRNA總量所占比例應(yīng)低于40%。2組人群血清中Small RNA分類注釋結(jié)果見(jiàn)表2、表3。

2.3 新miRNA前體預(yù)測(cè)及不同長(zhǎng)度候選miRNA首位基因偏向性分析 miRNA前體的標(biāo)志性發(fā)夾結(jié)構(gòu),能夠用來(lái)預(yù)測(cè)新的miRNA。深圳華大基因研究院開(kāi)發(fā)出了一套miRNA預(yù)測(cè)軟件Mireap,通過(guò)對(duì)截取一定長(zhǎng)度Small RNA比對(duì)上的基因組序列,探尋其二級(jí)結(jié)構(gòu)及Dicer酶切位點(diǎn)信息、能量等特征,從所得到的Small RNA中篩選出有可能成為新的miRNA的片段,其統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表4。不同長(zhǎng)度的候選miRNA的首位點(diǎn)堿基分布統(tǒng)計(jì)分析見(jiàn)表5、表6,所有候選miRNA各位點(diǎn)堿基分布的統(tǒng)計(jì)見(jiàn)表7、表8。通過(guò)對(duì)不同長(zhǎng)度的候選miRNA的首位點(diǎn)堿基分布及所有候選miRNA各位點(diǎn)堿基分布的統(tǒng)計(jì),可根據(jù)已知miRNA的堿基偏好性的統(tǒng)計(jì),對(duì)預(yù)測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

表3 結(jié)核病組血清中Small RNA在各類中的分布

表4 兩種人群血清中新miRNA前體預(yù)測(cè)統(tǒng)計(jì)

表5 非結(jié)核病組血清中不同長(zhǎng)度候選miRNA首位堿基偏向性

表6 結(jié)核病組血清中不同長(zhǎng)度候選miRNA首位堿基偏向性

表7 非結(jié)核病組血清中候選miRNA各位點(diǎn)堿基分布的統(tǒng)計(jì)

表8 結(jié)核病組血清中候選miRNA各位點(diǎn)堿基分布的統(tǒng)計(jì)

續(xù)表8

3 討論

Small RNA是生物體內(nèi)一類重要的功能分子,它的功能是誘導(dǎo)基因沉默,調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng),發(fā)育,基因轉(zhuǎn)錄和翻譯等生物過(guò)程。人們一般將其歸為三類：微 RNA(miRNA)、小干擾 RNA(siRNA)和與PIWI蛋白相互作用的 RNA(piRNA)[8]。其中：miRNA是一種進(jìn)化上高度保守、大小約20～25個(gè)堿基的單鏈小分子RNA,可通過(guò)調(diào)控基因表達(dá)等方式廣泛參與機(jī)體的發(fā)育、細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡、免疫調(diào)節(jié)等過(guò)程[9];siRNA是一些雙鏈的RNA在細(xì)胞內(nèi)被特異地切割并加工成長(zhǎng)度為21～25核苷酸的小分子 RNA,它能結(jié)合與之相似的mRNA分子抑制相應(yīng)蛋白質(zhì)的表達(dá)而致基因沉默[10];piRNA的長(zhǎng)度為26～31個(gè)核苷酸,只存在于哺乳動(dòng)物的睪丸中,推測(cè)與RNA沉默作用有關(guān)[11]。由此可見(jiàn),Small RNA在生命活動(dòng)中發(fā)揮著重要的作用。目前也有眾多的研究顯示Small RNA參與了許多疾病的病理過(guò)程,其中與腫瘤關(guān)系的研究更成為近年來(lái)生命科學(xué)的熱點(diǎn),它們與多種惡性腫瘤如肺癌、乳腺癌等之間的關(guān)系被相繼報(bào)道[12-14]。

循環(huán)系統(tǒng)中的Small RNA現(xiàn)在也進(jìn)入了研究工作者的視線,張玉靜等[15]報(bào)告分泌的miRNA能夠以信號(hào)分子的形式調(diào)節(jié)細(xì)胞間的信息交流。在人血細(xì)胞和培養(yǎng)的THP-1細(xì)胞內(nèi),miR-150被選擇性的包裝成超微小囊,并且分泌活躍。THP-1起源的超微小囊能夠進(jìn)入并把miR-150傳遞給HMEC-1細(xì)胞。miR-150可以高效的降低c-Myb的表達(dá)并且加強(qiáng)HMEC-1細(xì)胞的移行。Mitchell等和其他2個(gè)工作組研究發(fā)現(xiàn),循環(huán)miRNA有希望成為前列腺癌、妊娠、卵巢癌的生物學(xué)標(biāo)記[16-18]。通過(guò)分析正常生理?xiàng)l件和其他各種疾病狀態(tài)下血清中miRNA表達(dá)譜的特征,發(fā)現(xiàn)血清中的miRNA并不只來(lái)源于血細(xì)胞,也來(lái)源于受疾病直接影響的組織和細(xì)胞[19]。有意思的是血清來(lái)源的miRNA可以耐受RNaseA的消化作用,這與組織和細(xì)胞提取的RNA不同[19]。所以我們可以通過(guò)分析不同狀態(tài)下人群血清中的miRNA表達(dá)差異,篩選出具有診斷意義的miRNA。同時(shí)這也是對(duì)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)內(nèi)容的補(bǔ)充。我們可以分析這些差異表達(dá)的miRNA出現(xiàn)的機(jī)制及其對(duì)機(jī)體的影響,從而使我們可以更詳細(xì)的認(rèn)識(shí)結(jié)核病,提供治療結(jié)核病新的方法思路。

綜上所述,結(jié)核病人群體內(nèi)Small RNA表達(dá)譜發(fā)生了變化。這些差異表達(dá)的Small RNA可能通過(guò)調(diào)節(jié)對(duì)應(yīng)靶基因而導(dǎo)致結(jié)核病發(fā)生發(fā)展及其轉(zhuǎn)歸、或者是與耐藥結(jié)核病發(fā)生有關(guān)。本項(xiàng)目研究只是結(jié)核病人群血清中Small RNA表達(dá)譜的初步分析,這將為后續(xù)對(duì)研究Small RNA與結(jié)核病之間的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

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Analysis of the expression profile for serum small RNAs from tuberculosis patients

Zhong Qiu,Zhou Lin,Qian Ming,Chen Tao,Chen Liang,Li Haicheng
(Guangdong Institute for Tuberculosis Prevention and Treatment,Guangzhou510630,China)

ObjectiveT o analyze the expression profile of serum small RNAs(sRNA)from tuberculosis(TB)patients,and find a new way to study the regulatory mechanisms in the process of tuberculosis.MethodsSmall RNAs from Solexa deep sequencing covered almost every kind of RNA,including miRNA,siRNA,piRNA,rRNA,tRNA,snRNA,snoRNA,repeat associated sRNA and degraded tags of exon or intron.By comparing our sequences with those in databases and picking out the overlap on genome location between our data and the databases,sRNAs can be annotated into different categories.Those which can not be annotated will be used to predict novel miRNA by the self-developed software Mireap.ResultsIn the sera from non-TB patients group,109 630 different types containing 2 759 795 sequences of small RNAs were found,,in which there were 84 different types containing 1 433 sequences of miRNA candidates.In the sera from TB patients group,97 614 different types containing 1 452 119 sequences of small RNAs were found,in which there were 65 different types containing 755 sequences of miRNA candidates.ConclusionsThe expression profiles of serum small RNAs are different between TB patients and non-TB patients.

tuberculosis/blood;micro RNAs;gene expression

Zhong Qiu(gdtb_bg@vip.163.com)

鐘球(gdtb_bg@vip.163.com)

1.廣東省自然科學(xué)基金(9151051501000003);2.國(guó)家十一五重大專項(xiàng)：結(jié)核病發(fā)病模式的研究項(xiàng)目(2008ZX10003-007)。

2011-03-28)

(本文編輯：范永德)