松蘿酸自微乳和滴丸在大鼠體內(nèi)的藥物動力學(xué)研究

趙 穎， 宋 丹， 陶建生， 張 彤， 王昌華

(1.重慶理工大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院，重慶 400054;2.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，上海 201203;3.重慶市中藥研究院，重慶 400065)

松蘿酸是目前最重要的也是分布最廣的地衣酸之一，具有抗腫瘤［1］、殺蟲、抗病毒［2］、抗炎、抗菌［3-4］、促進(jìn)皮膚創(chuàng)傷愈合［5］等作用，松蘿酸的藥理活性較強(qiáng)，開發(fā)新藥具有一定的價值，但松蘿酸為難溶性藥物，溶解度和溶出度較差，體內(nèi)生物利用度不高。目前對松蘿酸的新劑型及藥動學(xué)方面的研究較少，本實驗制備了松蘿酸自微乳(Usnic Acid Self-microemulsify Drug Delivery System，UASMEDDS)和滴丸劑(Usnic acid Dropping pills)，以兩種制劑為研究對象，建立大鼠血漿中松蘿酸的HPLC測定方法，以松蘿酸混懸液為參比制劑，考察了松蘿酸兩種制劑口服給藥后大鼠體內(nèi)藥動學(xué)過程。

1 材料

1.1 藥品和試劑 松蘿酸(usnic acid)對照品(由重慶市中藥研究院藥化室宋丹副研究員提供，經(jīng)HPLC定量測定純度≥99%);松蘿酸原料藥(從地茶科地茶屬植物雪地茶Thamnolia subuliformis(Ehrh.)W.Culb.中分離制備，批號 20080325，含量≥98%);松蘿酸自微乳(自制，批號20081225);松蘿酸滴丸(自制，批號20081211);松蘿酸混懸液(自制，以1%CMC-Na為溶劑)。甲醇為色譜純，其余試劑為分析純，蒸餾水為重蒸水。

1.2 動物 SPF級SD大鼠，體質(zhì)量220～240 g，由重慶市中藥研究院動物室提供，合格證號:SCXK(渝)20020004號。

1.3 儀器 島津LC-20A高效液相色譜儀;紫外檢測器;SB2200超聲清洗機(jī)(SHANGHAI BRANSON);AUW-220D電子天平(日本島津);XW-80A型漩渦混合器(上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠);TGL-16C離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

2 松蘿酸自微乳和滴丸的制備

2.1 松蘿酸自微乳的制備 用 Maisine35-l、Labrafac Lipophile WL 1349作為混合油相，Cremophor RH40作為表面活性劑，Transcutol P作為助表面活性劑制備自微乳。精密稱取處方量的混合油相、表面活性劑和助表面活性劑置于具塞三角錐形瓶中，50℃水浴中混勻后，稱取松蘿酸原料藥加入到三角錐形瓶中，置于37℃水浴中緩慢震蕩，直至藥物溶解形成透明、均一溶液，得松蘿酸自微乳。

2.2 松蘿酸滴丸的制備 將基質(zhì)PEG 4000置水浴上加熱熔化，熔化后將藥物按規(guī)定的比例加入基質(zhì)中，不斷攪拌加熱，控制溫度，混合均勻，保持一定溫度，置滴丸機(jī)貯液罐中。調(diào)節(jié)滴速30滴/min滴入冷凝液中，冷凝成丸。收集滴丸，吸除附于滴丸的冷凝劑，干燥即得。

3 方法

3.1 色譜條件［6］SepaxSapphire C18色譜柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm);流動相:甲醇 ∶(50 mmol KH2PO4∶三乙胺500∶1)(70∶30);柱溫:40℃;體積流量:0.8 mL/min;檢測波長:285 nm。

3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 精密稱取松蘿酸對照品適量，加少量三氯甲烷溶解后用甲醇稀釋制成200.00 μg/mL的貯備溶液，備用。

3.3 血漿樣品處理 取血漿樣品200 μL，加入200 μL磷酸鹽緩沖液渦旋混勻振蕩提取30 s，加入600 μL甲醇旋渦混勻1 min，靜置5 min，10 000 r/min離心15 min，轉(zhuǎn)移上層清液于離心管中，過0.45 μm微孔濾膜，取濾過上清液20 μL進(jìn)樣分析。

3.4 給藥方案與樣品采集 取SD大鼠，隨機(jī)分組，每組6只。給藥前禁食12 h，自由飲水。以24 mg/kg的劑量分別灌胃給予松蘿酸各種制劑。松蘿酸混懸液組分別于給藥前及給藥后 1、2、4、8、12、24、36、48 h尾靜脈取血0.5 mL;松蘿酸滴丸組分別于給藥前及給藥后 0.5、1、2、4、8、12、24、48 h 尾靜脈取血0.5 mL;松蘿酸自微乳組分別于給藥前及給藥后 20，40 min，1、2、4、8、12、24 h 尾靜脈取血 0.5 mL，全血置于涂有EDTA的抗凝管中，3 000 r/min離心10 min分離血漿，－20℃保存至分析測定。測定前按3.3項血漿樣品處理方法處理，HPLC測定松蘿酸。

3.5 數(shù)據(jù)處理 血藥濃度數(shù)據(jù)由中國藥學(xué)會藥理學(xué)委員會編制的3P97藥動學(xué)程序進(jìn)行處理。

圖1 血漿中松蘿酸HPLC色譜圖A.松蘿酸標(biāo)準(zhǔn)品 B.空白血漿 C.空白血漿+松蘿酸 D.樣品Fig.1 Chromatograms of usnic acid in rat plasmaA.usnic acid B.blank plasma sample C.blank plasma and usnic acid D.sample

4 結(jié)果

4.1 方法專屬性 在本實驗所采用的色譜條件下，測得松蘿酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液、大鼠空白血漿、空白血漿加一定濃度松蘿酸溶液及給藥后血漿樣品的HPLC色譜圖見圖1。結(jié)果表明，在上述色譜條件下，松蘿酸與血漿內(nèi)源性物質(zhì)分離情況良好，無雜質(zhì)峰干擾。

4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性關(guān)系 取大鼠空白血漿7份，每份150 μL，精密加入稀釋成不同倍數(shù)的松蘿酸貯備溶液50 μL，配制成最終質(zhì)量濃度分別為0.025、0.25、2.5、6.25、12.5、25、50 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)含藥血漿，按3.3項血漿樣品處理方法處理，計算松蘿酸的峰面積，用藥物質(zhì)量濃度 C與峰面積比作線性回歸，得血漿中松蘿酸含量標(biāo)準(zhǔn)曲線。回歸方程為Y=55 473X+4 878.2，r=0.999 3，血漿中松蘿酸在0.025～50 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。按色譜條件測得松蘿酸在大鼠血漿中的最低檢測限為0.005 μg/mL。

4.3 方法精密度試驗 取大鼠空白血漿和松蘿酸標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液，配制成最終質(zhì)量濃度分別為0.025、6.25、25 μg/mL，各5 份。按3.3 項血漿樣品處理方法操作，于一日內(nèi)連續(xù)進(jìn)行HPLC測定，并計算得日內(nèi)差;連續(xù)測定5 d，計算得日間差。低、中、高濃度的日內(nèi)精密度 RSD 分別為5.05%、2.23%、4.12%;5 d的日間精密度 RSD分別為6.25%、3.05%、5.27%。表明該方法重現(xiàn)性、重復(fù)性良好，符合生物樣品定量測定要求。

4.4 方法回收率 大鼠尾靜脈取血0.4 mL，全血置于涂有EDTA的抗凝管中，精密加入稀釋成不同倍數(shù)的松蘿酸貯備溶液100 μL，配制成最終質(zhì)量濃度為 0.025、6.25、25 μg/mL 含松蘿酸血液樣品，3 000 r/min離心10 min分離血漿，取含藥大鼠血漿200 μL，按3.3項血漿樣品處理方法處理，在上述色譜條件下，每一濃度平行操作5次，求得實測濃度，計算方法回收率。結(jié)果表明，低、中、高各濃度的平均回收率分別為 98.57%、98.38%、93.46%，RSD分別為 10.10%、7.31%、6.61%。

4.5 松蘿酸制劑口服給藥后大鼠體內(nèi)藥動學(xué)研究

按3.4項下操作，大鼠灌胃給予松蘿酸混懸液、松蘿酸滴丸和松蘿酸自微乳后，測定松蘿酸各制劑對應(yīng)時間點血漿中松蘿酸峰面積，并根據(jù)回歸方程計算血藥濃度，松蘿酸在大鼠體內(nèi)的平均血藥濃度-時間曲線見圖2。

結(jié)果表明，各制劑組的達(dá)峰濃度均顯著高于參比制劑松蘿酸混懸液，松蘿酸滴丸的達(dá)峰濃度最大，松蘿酸自微乳和滴丸的藥-時曲線下面積明顯大于混懸液。

4.6 松蘿酸各制劑組藥動學(xué)參數(shù)的比較 采用3P97藥動學(xué)程序處理松蘿酸混懸液和各制劑組平均血藥濃度數(shù)據(jù)，根據(jù)AIC值最小法和WSS綜合判斷各組隔室模型。結(jié)果表明，松蘿酸混懸液和各制劑組在大鼠體內(nèi)給藥后均符合單室一級吸收模型，權(quán)重系數(shù)為1/C2。各制劑組主要藥動學(xué)參數(shù)見表1。

圖2 松蘿酸各組制劑的平均血藥濃度-時間曲線Fig.2 Mean plasma concentration-time cuvres of usnic acid in rats after oral administration different formulations of usnic acid(n=6)

表1 松蘿酸各種制劑主要藥動學(xué)參數(shù)Tab.1 Pharmacokinetic parameters for usnic acid in rats after oral administration different formulations of usnic acid

5 討論

5.1 由全血制備血漿時，離心速度過高，血細(xì)胞易破裂而使血漿帶紅色，因此離心速度一般控制在3 000 r/min為宜。血漿樣品處理方法和已有文獻(xiàn)報道方法相比［7］操作簡單，藥物提取率高，方法回收率好。

5.2 在測定生物樣本時，需要建立適合的體內(nèi)定量測定方法，并要求方法具有專屬性、準(zhǔn)確度、靈敏度。本實驗建立了松蘿酸動物體內(nèi)血漿樣品的高效液相色譜分析方法，進(jìn)行方法學(xué)驗證，主要考察了方法的專屬性、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備與線性范圍、精密度和方法回收率，均達(dá)到生物樣品分析的要求，制定的分析方法專屬性、準(zhǔn)確度和靈敏度均較好。在此色譜條件下，松蘿酸分離度良好，無干擾。

5.3 大鼠分別以24 mg/kg的劑量灌胃給予松蘿酸混懸液、松蘿酸自微乳和松蘿酸滴丸后，Tmax分別為2.350 h、2.968 h 和3.125 h;Cmax分別為12.431 μg/mL、36.860 μg/mL 和42.392 μg/mL;AUC0-∝分別為129.783 μg/(mL·h)、660.934 μg/(mL·h)和646.777 μg/(mL·h)。比較松蘿酸各制劑的藥動學(xué)參數(shù)可以看出，各組吸收速度常數(shù)差異不大;消除速度常數(shù)混懸液組 ＞滴丸組 ＞自微乳組(P＜0.05);松蘿酸滴丸和松蘿酸自微乳的達(dá)峰時間(Tmax)和混懸液劑差異不大，峰濃度(Cmax)均顯著高于混懸液劑(P＜0.05)，兩種制劑的藥-時曲線下面積(AUC)明顯大于混懸液劑(P＜0.05)，松蘿酸自微乳和松蘿酸滴丸的消除半衰期t1/2(ke)明顯延長。和參比制劑松蘿酸混懸液比較，松蘿酸自微乳與松蘿酸滴丸的相對生物利用度分別為509.3%、498.4%，兩種制劑的相對生物利用度均顯著提高。

建立了松蘿酸血漿樣品高效液相色譜分析方法，血漿樣品穩(wěn)定性、方法精密度、方法回收率符合要求。藥動學(xué)數(shù)據(jù)結(jié)果表明，對照組和各制劑組在大鼠體內(nèi)給藥后均符合單室一級吸收模型。和參比制劑松蘿酸混懸液比較，松蘿酸自微乳與滴丸兩種制劑的相對生物利用度均顯著提高。將難溶性藥物松蘿酸通過制劑增溶技術(shù)制備成松蘿酸自微乳和滴丸兩種藥物新型給藥系統(tǒng)后，其體內(nèi)生物利用度得到顯著提高，劑型設(shè)計達(dá)到了預(yù)期目的。本實驗可為開發(fā)松蘿酸兩種制劑提供體內(nèi)藥物動力學(xué)參考。

［1］Mayer M A C，Oneil M A E，Murray K E E，et al.Usnic acid:a non-genotoxic compound with anti-cancer properties［J］.Anti Cancer Drug，2005，16(8):805-809.

［2］Campanella L，Delfini M，Ercole P，et al.Molecular characterization and action of usnic acid:a drug that inhibits proliferation of mouse polyomavirusin vitroand whose main target is RNA transcription［J］.Biochimie，2004，84(4):329-334.

［3］Lauterwein M，Oethinger M，Belsner K，et al.In vitroactivities of the lichen secondary metabolites vulpinic acid，(+)-usnic acid and(-)-usnic acid against aerobic and anaerobic microorganisms［J］.Antimicrob Agents Chemother，1995，39(11):2541-2543.

［4］Vijayakumar C S.Viswanathan.Anti-inflammatory activity of(+)-usnic acid［J］.Fitoterapia，2000，71(5):564-566.

［5］靳菊情，董亞琳，賀浪沖.松蘿酸鈉促皮膚創(chuàng)傷愈合的實驗研究［J］.中藥材，2005，28(2):109-111.

［6］趙 穎，宋 丹，鐘國躍，等.HPLC法測定雪地茶中松蘿酸［J］.中草藥，2009，40(增刊):281-282.

［7］賀浪沖，焦欣慶，白碩可，等.反相高效液相色譜法測定血清中松蘿酸濃度［J］.分析化學(xué)，1996，24(7):858.