甘草飲片乙酸乙酯提取部位HPLC指紋圖譜研究

蘇本正， 周 倩， 孫立立*

(1.山東省中醫(yī)藥研究院，山東濟(jì)南 250014;2.山東中藥醫(yī)藥大學(xué)，山東濟(jì)南 250014)

甘草為豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFischer.、脹果甘草Glycyrrhiza inflateBat.或光果甘草Glycyrrhiza glabraL.的干燥根和根莖［1］。甘草為臨床常用中藥，是我國(guó)2000種草藥中用量最大的一味藥材［2］。臨床上以飲片入藥，常見(jiàn)的飲片規(guī)格為生品和炙品兩種。但是，中藥飲片的炮制缺乏標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程的現(xiàn)象目前還相當(dāng)突出［3-5］，需要建立完善的炮制標(biāo)準(zhǔn)來(lái)規(guī)范它。甘草生品具有補(bǔ)脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳、緩急止痛和調(diào)和藥性的功效，經(jīng)蜜炙后增強(qiáng)了其補(bǔ)脾益氣的作用，以補(bǔ)脾和胃、益氣復(fù)脈為主［6-8］。中藥炮制后藥效改變的根本原因是炮制引起了中藥化學(xué)成分的變化，前期對(duì)甘草及蜜炙甘草的HPLC指紋圖譜研究［9］發(fā)現(xiàn)，炮制后化學(xué)成分的確發(fā)生了一定的變化。單獨(dú)的一兩個(gè)成分的測(cè)定，不能系統(tǒng)、完整地反映甘草的內(nèi)在質(zhì)量，目前指紋圖譜已成為國(guó)際公認(rèn)的控制中藥質(zhì)量的有效手段［10-12］，為進(jìn)一步追蹤變化成分所在部位，本實(shí)驗(yàn)提取了甘草乙酸乙酯提取部位，對(duì)其進(jìn)行了指紋圖譜研究，并對(duì)生、炙品進(jìn)行了初步比較，從而為進(jìn)一步明確藥效改變的物質(zhì)基礎(chǔ)，解析甘草蜜炙原理提供依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

1 儀器與試藥

Waters 2695型高效液相色譜儀，Waters 2996 DAD檢測(cè)器，1/10萬(wàn)電子天平(Sartorius R200D，德國(guó))。乙腈為色譜純，水為超純水，甲醇、乙醇、乙酸乙酯、醋酸均為分析純。甘草苷對(duì)照品(批號(hào)11610-200604)購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。

甘草飲片:甘草01(產(chǎn)地內(nèi)蒙古)、甘草02(內(nèi)蒙古)、甘草03(甘肅)為自制甘草飲片，藥材購(gòu)自山東天一中藥飲片有限公司，甘草04(新疆)為自制甘草飲片，藥材購(gòu)自浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片廠;甘草05購(gòu)自寧夏銀川，產(chǎn)地內(nèi)蒙古;甘草06購(gòu)自濟(jì)南建聯(lián)大藥房，產(chǎn)地內(nèi)蒙古;甘草07購(gòu)自南京金陵大藥房，產(chǎn)地甘肅;甘草08購(gòu)自北京圣惠堂中藥飲片有限公司，產(chǎn)地內(nèi)蒙古;甘草09購(gòu)自濟(jì)南同仁堂藥店，產(chǎn)地內(nèi)蒙古;甘草10購(gòu)自山東天一中藥飲片有限公司，產(chǎn)地新疆。

炙甘草飲片:炙甘草01、炙甘草02、炙甘草03、炙甘草04分別為甘草01、02、03和04制得蜜炙甘草飲片。炙甘草05購(gòu)自浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片廠，產(chǎn)地新疆;炙甘草06購(gòu)自山東天一中藥飲片有限公司，產(chǎn)地新疆;炙甘草07購(gòu)自濟(jì)南建聯(lián)大藥房，產(chǎn)地內(nèi)蒙古;炙甘草08購(gòu)自北京圣惠堂中藥飲片有限公司，產(chǎn)地內(nèi)蒙古;炙甘草09購(gòu)自濟(jì)南同仁堂藥店，產(chǎn)地內(nèi)蒙古;炙甘草10購(gòu)自南京金陵大藥房，產(chǎn)地甘肅。

2 試驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Hyperclone ODS C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);流動(dòng)相:乙腈-冰醋酸水溶液(0.2%);柱溫:30℃;流速:1 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):310 nm。梯度條件見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫程序表Tab.1 Gradient elution

2.2 供試品溶液制備 取(炙)甘草粗粉10 g，加入10倍量水，回流提取3次，每次1 h，濾過(guò)，合并濾液，將濾液濃縮至10 mL，加入乙醇使含醇量達(dá)到80%，靜置24 h，濾過(guò)，濾液濃縮至無(wú)醇味，繼續(xù)濃縮至稠膏狀，加入適量水使溶解，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液減壓回收乙酸乙酯至干，加適量甲醇使溶解，并定容至10 mL，混勻，精密吸取1 mL至25 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.3 對(duì)照品溶液制備 取甘草苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含20 μg的溶液，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 對(duì)照試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，依法測(cè)定，記錄色譜圖。見(jiàn)圖1。

圖1 甘草苷對(duì)照品色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of glycyrrhizin

2.4.2 精密度試驗(yàn) 取炙甘草02供試品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，以甘草苷的保留時(shí)間和峰面積為參照，分別對(duì)各主要色譜峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。結(jié)果表明:各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積基本一致，RSD均小于3%，符合指紋圖譜要求。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取炙甘草02供試品溶液，在室溫下保存，分別于 0，3，6，9，12 h 測(cè)定，以甘草苷保留時(shí)間和峰面積為參照，分別對(duì)各主要色譜峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。結(jié)果表明，各色譜峰的相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間基本一致，RSD均小于3%，符合指紋圖譜要求。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取炙甘草02飲片粗粉6份，按照供試品溶液的制備方法制成供試品溶液，依次測(cè)定，以甘草苷保留時(shí)間和峰面積為參照，分別對(duì)各主要色譜峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。結(jié)果表明，各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于3%，符合指紋圖譜要求。

2.5 炙甘草飲片乙酸乙酯部位指紋圖譜 取各炙甘草樣品，照2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，照上述色譜條件依法進(jìn)行測(cè)定，記錄HPLC色譜圖。以甘草苷為參照，對(duì)各主要色譜峰相對(duì)峰面積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 10批炙甘草乙酸乙酯部位指紋圖譜(相對(duì)峰面積)Tab.2 Relative peak area of HPLC fingerprint common peaks of honey-fried Glycyrrhizae Radix et Rhizoma

炙甘草乙酸乙酯部位共有峰的確定及指紋圖譜共有模式的建立 運(yùn)用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A版”對(duì)10批炙甘草乙酸乙酯部位指紋圖譜進(jìn)行相似度分析，以S1為參照?qǐng)D譜，經(jīng)過(guò)多點(diǎn)校正、自動(dòng)匹配，以中位數(shù)法，生成對(duì)照?qǐng)D譜R，由匹配數(shù)據(jù)的輸出結(jié)果得到共有峰共8個(gè)，分別為3.85、11.77、12.21、25.45、26.49、28.67、31.82、48.25 min處色譜峰，其中12.21 min峰為甘草苷。除上述色譜峰，在11.01 min左右，除炙甘草02和10外有一共有峰，在34.7和42.70 min左右除炙甘草02和09外有一共有峰，44.496 min除了炙甘草01，02，03和炙甘草09外有一共有峰，56.72 min炙甘草04，05，06有一共有峰，58.63 min炙甘草05較其他甘草多一色譜峰。見(jiàn)圖2。

圖2 10批炙甘草飲片色譜疊加圖(R為對(duì)照?qǐng)D譜)Fig.2 The overlapped chart for ten batches of honey-fried Glycyrrhizae Radix et Rhizoma(R is comparison chart)

指紋圖譜的相似度評(píng)價(jià)使用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A版”進(jìn)行相似度分析，結(jié)果見(jiàn)表3，經(jīng)分析，10批次炙甘草飲片與相應(yīng)對(duì)照?qǐng)D譜的相似度均大于0.90，符合要求。

表3 與共有模式比較的蜜炙甘草相似度Tab.3 Results of similarity analysis of honey-fried Glycyrrhizae Radix et Rhizoma

2.6 生甘草飲片乙酸乙酯部位指紋圖譜 取各生甘草樣品照2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，照上述色譜條件依法進(jìn)行測(cè)定，記錄HPLC色譜圖，以甘草苷為參照，對(duì)各主要色譜峰相對(duì)峰面積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見(jiàn)表4。

生甘草乙酸乙酯部位共有峰的確定及指紋圖譜共有模式的建立運(yùn)用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A版”對(duì)10批生甘草乙酸乙酯部位指紋圖譜進(jìn)行相似度分析。以S1為參照?qǐng)D譜，經(jīng)過(guò)多點(diǎn)校正、自動(dòng)匹配，以中位數(shù)法，生成對(duì)照?qǐng)D譜R，由匹配數(shù)據(jù)的輸出結(jié)果得到共有峰共10個(gè)，分別為11.01、11.77、12.21、25.47、26.505、28.67、31.81、34.71、42.69、48.24 min。此外，在 17.89min 飲片01、02、06、08、09 有峰，43.97 min 飲片 05 有峰，在44.49 min飲片04、05和10有峰，52.68和56.74 min飲片04和10有峰，58.66 min飲片04有峰。見(jiàn)圖3。

表4 10批甘草乙酸乙酯部位指紋圖譜相對(duì)峰面積Tab.4 Relative peak area of HPLC fingerprint common peaks of Glycyrrhizae Radix et Rhizoma

圖3 10批生甘草飲片指紋圖譜(R為對(duì)照?qǐng)D譜)Fig.3 The overlapped chart for ten batches of Glycyrrhizae Radix et Rhizoma(R is comparison chart)

指紋圖譜的相似度評(píng)價(jià)使用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A版”進(jìn)行相似度分析，結(jié)果見(jiàn)表5，經(jīng)分析，10批次生甘草飲片與相應(yīng)對(duì)照?qǐng)D譜的相似度均大于0.90，符合要求。

2.7 生炙飲片乙酸乙酯部位比較 炙甘草01、02、03和04分別由甘草01、02、03和04制得，分別對(duì)01，02，03和04甘草炮制前后峰面積進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)，比較甘草乙酸乙酯提取部位炮制前后的變化情況，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 與共有模式比較的生甘草相似度Tab.5 Results of similarity analysis of Glycyrrhizae Radix et Rhizoma

由表5可見(jiàn)，在四產(chǎn)地甘草共有峰中，10.99、11.74、12.19、25.34、26.42、28.53、34.63、42.67、48.22 min色譜峰經(jīng)蜜炙后峰面積減小，3.85 min色譜峰經(jīng)蜜炙后峰面積增加，其余各色譜峰，4.86 min和7.67 min(甘草04無(wú))色譜峰經(jīng)蜜炙后峰面積增加，10.62 min色譜峰(甘草01和04無(wú))，17.89 min(甘草03和04無(wú))、53.53 min(甘草04無(wú))色譜峰經(jīng)蜜炙后峰面積減小，另甘草04在44.44、52.68、56.74和58.66 min較其他甘草多一色譜峰，峰面積經(jīng)蜜炙后減小。31.73 min色譜峰炙甘草01和03峰面積略有增加，但與生品相比差異較小，炙甘草02和04峰面積減少，考慮炮制對(duì)其影響較小或?yàn)榉e分誤差所致。

表5 生炙甘草乙酸乙酯提取部位主要色譜峰峰面積比較Tab.5 Comparison of chemical constituents between Glycyrrhizae Radix et Rhizoma and processed products

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究建立了甘草飲片乙酸乙酯提取部位的指紋圖譜，得到指紋圖譜各色譜峰分離度較好，基線平穩(wěn)，色譜信息較為豐富，而且色譜峰分布均勻，參照峰甘草苷(保留時(shí)間12.2 min)與其他色譜峰分離度良好。

通過(guò)測(cè)定，不同產(chǎn)地甘草飲片與生成的對(duì)照?qǐng)D譜比較相似度良好，均大于0.90。各主要色譜峰相對(duì)保留時(shí)間基本一致，符合指紋圖譜的要求。但所含成分有所差異，且峰面積差別較大，說(shuō)明產(chǎn)地不同其成分之間會(huì)有一定的差異。

通過(guò)對(duì)生炙甘草比較發(fā)現(xiàn)，甘草與炙甘草乙酸乙酯部位的化學(xué)成分有所不同，各成分的含量比例關(guān)系發(fā)生了變化，且有新的化學(xué)成分產(chǎn)生。11 min之前的色譜峰蜜炙后峰面積普遍增大，11 min之后色譜峰峰面積經(jīng)蜜炙后降低，說(shuō)明蜜炙使極性較大成分含量增加，極性較小的成分含量降低。該變化可能為甘草藥效作用改變的物質(zhì)基礎(chǔ)。要想明確甘草蜜炙炮制原理，還需進(jìn)一步對(duì)其他提取部位進(jìn)行分析，同時(shí)分離炮制前后變化明顯的化學(xué)成分，對(duì)其進(jìn)行生理活性篩選，尋找炙甘草藥理活性成分，從而為炙甘草炮制工藝和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供有效的質(zhì)控指標(biāo)，全面提高飲片質(zhì)量，以保證中醫(yī)臨床用藥的安全性和有效性提供依據(jù)。

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