基于調(diào)脂抗氧化有效部位的降脂寧HPLC指紋圖譜研究

羅 文， 劉 斌，2*， 王 偉， 石任兵，2

(1.北京中醫(yī)藥大學，北京 100102;2.國家中醫(yī)藥管理局中藥經(jīng)典名方有效物質(zhì)發(fā)現(xiàn)重點研究室，北京 100102)

降脂寧由山楂、制首烏、決明子、荷葉四味中藥 組成，載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準》(中藥)第十三冊［1］，具有降血脂、軟化血管作用［2］，臨床用于預(yù)防和治療高脂血癥。我們采用大孔樹脂吸附技術(shù)，結(jié)合藥理學研究，篩選確定了降脂寧調(diào)脂抗氧化有效部位［3－6］。本實驗建立了基于調(diào)脂抗氧化有效部位的降脂寧HPLC指紋圖譜，并通過復方與組方各藥材 HPLC 指紋圖譜［7－9］的相關(guān)性研究，對降脂寧HPLC指紋圖譜色譜峰進行了歸屬。

1 儀器與試藥

Waters高效液相色譜儀，包括1525型二元高壓梯度泵，2487型二級管陣列檢測器和1500型柱溫箱(美國 Waters公司);Sartorious BT 25S型 1/100000電子分析天平(北京賽多利斯儀器有限公司);KQ－500DE型超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司)。

1～9批組方藥材山楂、制首烏、決明子、荷葉購自全國各地，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學張貴君教授鑒定分別為薔薇科植物山里紅Crataegus pinnatifidaBge.var.major N.E.Br.的干燥成熟果實、蓼科植物何首烏Polygonum multiflorumThunb.的干燥塊根、豆科植物決明子Cassia obtusifoliaL.的干燥成熟種子和睡蓮科植物蓮Nelumbo nuciferaGaertn.的干燥葉;第10批組方藥材山楂、制首烏、決明子、荷葉均為對照藥材，購自中國藥品生物制品檢定所。2，3，5，4’－四羥基二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷對照品(批號:08440－200402)購自中國藥品生物制品檢定所。

乙腈(Sigma－aldrich公司，色譜純);屈臣氏重蒸水;其他試劑為分析純，購自北京北化精細化學品有限責任公司。

2 樣品溶液制備

2.1 降脂寧調(diào)脂抗氧化有效部位制備 參照文獻［3］方法，制備降脂寧調(diào)脂抗氧化有效部位。

2.2 參照物溶液 精密稱取2，3，5，4’－四羥基二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷對照品3.66 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，精密移取1 mL，置10 mL量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為參照物溶液。

2.3 供試品溶液 取降脂寧調(diào)脂抗氧化有效部位約25 mg，精密稱定，置錐形瓶中，加50%乙醇10 mL，稱定重量，超聲提取30 min，放冷，再稱定重量，用50%乙醇補足減失的重量，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

3 色譜條件

色譜柱:Agilent TC－C18柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm)，流動相:0.01%甲酸水溶液(A)－乙腈(B)(0～40 min，97:3～86:14;40 ～65 min，86:14 ～84:16;65～100 min，84:16～70:30;100～110 min，70:30 ～50:50;110～120 min，50:50～0:100)。流速:1.0 mL/min，檢測波長:280 nm;柱溫:30℃。

4 方法學考察

4.1 精密度試驗 精密吸取2.3項下供試品溶液10 μL，連續(xù)進樣 5 次，測定 HPLC 圖譜。以 2，3，5，4’－四羥基二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷峰(峰 16)為參照峰，計算各共有峰相對保留時間RSD值＜2%，相對峰面積RSD值＜3%。表明方法精密度良好。

4.2 穩(wěn)定性試驗 精密吸取2.3項下供試品溶液，分別于制備后 3、6、9、12、15、18、24 h 進樣，測定HPLC 圖譜。以 2，3，5，4’－四羥基二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷峰(峰16)為參照峰，計算各共有峰相對保留時間RSD值＜2%，相對峰面積RSD值＜3%。表明供試品溶液在24h穩(wěn)定。

4.3 重復性試驗 取同批次藥材5份，制備5批降脂寧調(diào)脂抗氧化有效部位。分別取5批有效部位各約25 mg，精密稱定，按2.3項下方法制備供試品溶液，進樣，測定 HPLC 圖譜。以 2，3，5，4’－四羥基二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷峰(峰16)為參照峰，計算各共有峰相對保留時間RSD值＜2%，相對峰面積RSD值＜3%。表明方法重復性良好。

5 指紋圖譜建立

5.1 指紋圖譜及技術(shù)參數(shù) 取同批次藥材和不同批次藥材，分別制備10批降脂寧調(diào)脂抗氧化有效部位。按2.3項下方法制備供試品溶液，進樣，測定HPLC圖譜。采用國家藥典委員會中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)，進行時間窗設(shè)定、譜峰匹配，確定降脂寧指紋圖譜29個共有色譜峰，見圖1、2。選擇2，3，5，4’－四羥基二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷峰(峰16)作為參照峰，計算各共有指紋峰相對保留時間 和相對峰面積，結(jié)果見表1～4。

圖1 降脂寧調(diào)脂抗氧化有效部位HPLC指紋圖譜色譜峰S.2，3，5，4’－四羥基二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷Fig.1 The chromatographic peaks in the fingerprint of the lipid-regulation and anti-oxidation effective fraction of Jiangzhining granulesS.2，3，5，4’－Tetrahydroxystilbene－2－O－β－D－glucoside

圖2 降脂寧調(diào)脂抗氧化有效部位HPLC指紋圖譜R.對照圖譜S1～10.10批降脂寧調(diào)脂抗氧化有效部位A.同批次藥材 B.不同批次藥材Fig.2 The fingerprint of the lipid-regulation and anti-oxidation effective fraction of Jiangzhining granulesR.The reference fingerprint S1 ～ 10.10 batches of the lipid－regulation and anti－oxidation effective fraction of Jiangzhining granules A.The same batches of herbs B.The different batches of herbs

表1 共有峰相對保留時間(同批次藥材)Tab.1 The relative retention time of common peaks and their RSDs(the same batches of herbs)

表2 共有峰相對峰面積(同批次藥材)Tab.2 The relative retention areas of common peaks and their RSDs(the same batches of herbs)

表3 共有峰相對保留時間(不同批次藥材)Tab.3 The relative retention time of common peaks and their RSDs(the different batches of herbs)

表4 共有峰相對峰面積(不同批次藥材)Tab.4 The relative retention areas of common peaks and their RSDs(the different batches of herbs)

5.2 指紋圖譜相似度計算 應(yīng)用國家藥典委員會中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)計算軟件，計算各樣品指紋圖譜與共有模式對照圖譜R之間的相似度。結(jié)果同批次藥材制備有效部位相似度在0.994～0.998，不同批次藥材制備有效部位相似度在0.913～0.975之間。

6 指紋圖譜與組方藥材的相關(guān)性分析

采用2.1項和2.3項下方法，分別制備組方藥材制首烏、山楂、荷葉、決明子供試液，及分別缺制首烏、山楂、荷葉、決明子的陰性樣品溶液。按3項下色譜條件進樣分析，獲得各組方藥材及陰性樣品HPLC色譜圖。以色譜峰相對保留時間相對偏差為指標，對降脂寧指紋圖譜共有峰與組方藥材的相關(guān)性進行分析。結(jié)果峰1～4、8和9歸屬于山楂，峰5、6、11 ～13、15 和 17 ～19 歸屬于荷葉，峰 7、10、14和16歸屬于制首烏，峰20～29歸屬于決明子。

7 討論

7.1 色譜條件選擇 色譜柱分別試用了Agilent TC－C18柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm)、Waters Symmetry Shield RP18柱(4.6 mm ×150 mm，5μm)、SunFire C18柱(4.6 mm × 150 mm，5 μm)、Nova－Pak C18柱(3.9 mm × 150 mm，5 μm)和 Kromasil C18柱(4.6 mm ×150 mm，5 μm)，以 Agilent TC－C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)分離度好，色譜峰對稱性好，基線平穩(wěn)。分別選取238、254、280、320 nm作為檢測波長，以色譜峰數(shù)目及其積分面積為指標，確定檢測波長為280 nm。分別用水－乙腈、水－甲醇、0.1%甲酸水溶液－乙腈、0.01%甲酸水溶液－乙腈混合溶劑為流動相，以不同洗脫梯度進行試驗，確定了流動相及其洗脫梯度。

7.2 供試品溶液制備方法考察 取降脂寧調(diào)脂抗氧化有效部位4份，每份約25 mg，精密稱定，置錐形瓶中，分別加入水、甲醇、50%甲醇和50%乙醇各10 mL，稱重，超聲提取30 min，放冷，稱重，用相應(yīng)溶劑補足減失的重量，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。精密吸取供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，得到不同溶劑提取的可檢出成分譜。經(jīng)過分析可知50%乙醇提取獲得的成分數(shù)量較多且含量高，故選擇50%乙醇作為溶劑。另取降脂寧調(diào)脂抗氧化有效部位3份，每份約25 mg，精密稱定，置錐形瓶中，分別用50%乙醇10 mL以超聲30 min、回流30 min、浸泡24 h方式進行提取，放冷，稱重，用50%乙醇補足減失的重量，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。精密吸取供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，得到不同提取方式的可檢出成分譜。經(jīng)過分析可知超聲提取獲得的成分數(shù)量較多且含量高，故選擇超聲提取方式。

7.3 指紋圖譜評價 分別比較由同批次藥材和不同批次藥材制備的10批降脂寧調(diào)脂抗氧化有效部位指紋圖譜，發(fā)現(xiàn)其指紋圖譜中主要峰群的整體圖貌基本一致，雖然不同產(chǎn)地樣品中各成分含量的相對比值有一定差別，但10批樣品指紋圖譜相似度分別均在0.99和0.90以上。表明降脂寧調(diào)脂抗氧化有效部位制備工藝穩(wěn)定、重現(xiàn)性良好，建立基于調(diào)脂抗氧化有效部位的降脂寧HPLC指紋圖譜是可行的，不僅能夠從整體上全面而有效地控制降脂寧的質(zhì)量［10］，而且能夠?qū)崿F(xiàn)中藥復方指紋圖譜與其功效的有效鏈接，實現(xiàn)指紋圖譜化學物質(zhì)屬性與生物活性表征的有機結(jié)合，使指紋圖譜的質(zhì)量控制方法更有針對性。

7.4 復方指紋圖譜與組方藥材的相關(guān)性分析 以降脂寧為研究對象，在建立復方HPLC指紋圖譜基礎(chǔ)上，通過對各組方藥材及其陰性樣品HPLC圖譜的檢測，以色譜峰相對保留時間相對偏差為考察指標，對降脂寧指紋圖譜中的29個共有色譜峰進行歸屬。其中峰1～4，8，9來自山楂;峰20～29來自決明子;峰5，6，11 ～13，15，17 ～19 來自荷葉;峰7，10，14，16來自制首烏。該指紋圖譜相關(guān)性分析方法可較為準確地判別降脂寧指紋圖譜中主要色譜峰的歸屬，有助于快速確定降脂寧的化學成分組成;同時，若結(jié)合降脂寧藥理學指標分析，又可借此建立降脂寧與組方藥材藥效間的聯(lián)系，分析各藥材在降脂寧整體藥效中的作用，對降脂寧的組方原理和配伍理論研究也具有積極意義。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準.中藥成方制劑(第十三冊)［S］.1997:116.

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