湖北省煙草黑脛病菌生理小種研究初報(bào)

李錫坤，孔凡玉，李錫宏，王 靜，張成省，馮 超，陳雅瓊，劉 璇，蘇振剛，李佰樂

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，青島 266101；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京 100081；3.湖北省煙草研究所，武漢 430000；4.云南省玉溪市煙草公司，云南 玉溪 653100)

煙草黑脛病于 1896年在印度尼西亞的爪哇首次發(fā)現(xiàn)，此后迅速蔓延全世界，成為煙草生產(chǎn)上最具毀滅性的病害之一[1]。煙草黑脛病菌（Phytophthora parasitica var.nicotianae）可以為害所有栽培煙草，主要侵染煙草根部和莖基部，高溫、高濕有利于病原的侵染，隨著病害的發(fā)展，煙株根系和莖基部變黑腐爛，最終導(dǎo)致煙株死亡。20世紀(jì)60年代以來，美國(guó)、南非、印度、中國(guó)等主要產(chǎn)煙國(guó)對(duì)其致病性與生理分化進(jìn)行了研究[2]。迄今為止，國(guó)內(nèi)外已發(fā)現(xiàn)0號(hào)、1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)共4個(gè)煙草黑脛病生理小種。朱賢朝等[3-8]在20世紀(jì)80年代對(duì)我國(guó)煙草黑脛病菌生理小種的研究發(fā)現(xiàn)，我國(guó)存在 0號(hào)和1號(hào)生理小種及一個(gè)未鑒定出生理小種的致病型。李錫宏等[9]于1995—1998年從湖北恩施州煙草上采集到黑脛病標(biāo)樣102個(gè)，分離純化出46個(gè)菌系，用游動(dòng)孢子懸浮液注射 10葉期左右鑒別寄主的莖基部，所用鑒別寄主為L(zhǎng)8（具有N.longiflora抗性）、NC1071（具有N.Plumbaginifolia抗性）、N.nudicaulis和小黃金1025。結(jié)果表明，46個(gè)菌系對(duì)L8、NC1071和N.nudicaulis無致病力，為0號(hào)小種。本研究對(duì) 2009年采集的湖北煙草黑脛病菌進(jìn)行了生理小種的初步鑒定。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集與病原分離

1.1.1 樣品采集 自2009年7—9月，于湖北省主產(chǎn)煙區(qū)采集具有典型癥狀的煙草黑脛病標(biāo)樣 111個(gè)，分離純化得到煙草黑脛病病原菌樣本 30個(gè)。其中，烤煙標(biāo)樣22個(gè)，白肋煙標(biāo)樣7個(gè)，曬煙標(biāo)樣1個(gè)。

1.1.2 病原分離 取典型的煙草黑脛病病株，用自來水洗凈莖稈，將枝葉及根系等去除，在超凈工作臺(tái)內(nèi)用75%酒精擦拭莖稈后燒去殘余酒精，用滅菌解剖刀將莖稈縱向剖開，用滅菌鑷子夾取髓部碟片或滅菌解剖針挑取髓部碟片間菌絲放入選擇性燕麥培養(yǎng)基平板上，每皿均勻放置3～4塊，28 ℃溫箱中培養(yǎng)，2～4 d后挑取邊緣菌落純化。

1.2 培養(yǎng)基的制備

燕麥培養(yǎng)基配方[10]：燕麥片30 g，瓊膠17～20 g，水1 L。

選擇性燕麥培養(yǎng)基[11]：在燕麥培養(yǎng)基倒平板前（約冷卻到40 ℃）加入100 mg/L利福平、50 mg/L氨卞青霉素、50 mg/L五氯硝基苯和50 mg/L制霉菌素。

TTZ培養(yǎng)基[12]：TTZ液體培養(yǎng)基的基本成分為蔗糖30 g、檸檬酸20 g、氯化鈣1.0 g、硝酸鉀2.0 g、磷酸二氫鉀0.67 g、磷酸氫二鉀0.33 g、1%氯化鐵溶液10滴、VB11 mg和蒸餾水1 L。將上述各試劑在燒杯內(nèi)混勻溶解后，調(diào)節(jié)pH至5.5，121 ℃高壓蒸汽滅菌30 min，冷卻后加入經(jīng)細(xì)菌過濾器滅菌的0.05%（W/V）TTZ（2,3,5-氯化三苯基四氮唑，2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride）。

TTZ固體培養(yǎng)基為燕麥培養(yǎng)基在倒平板前（冷卻至約 40 ℃）加入經(jīng)細(xì)菌過濾器滅菌的 0.05%(W/V)TTZ[13]。

1.3 TTZ顏色反應(yīng)鑒定

1.3.1 TTZ液體培養(yǎng)基中的顏色反應(yīng) 供試煙草的黑脛病菌在28 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3～5 d，用直徑為 5 mm的打孔器取邊緣菌齡一致的菌塊，移入TTZ液體培養(yǎng)基中，以不加TTZ的液體培養(yǎng)基為對(duì)照，處理和對(duì)照皆設(shè)3個(gè)重復(fù)。置于28 ℃培養(yǎng)箱，接種后72 h分別觀察培養(yǎng)基及菌體的顏色變化。

1.3.2 TTZ固體培養(yǎng)基中的顏色反應(yīng) 供試煙草的黑脛病菌在28 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3～5 d，用直徑為 5 mm的打孔器取邊緣菌齡一致的菌塊，移入TTZ固體培養(yǎng)基中，以不加TTZ的燕麥瓊脂培養(yǎng)基為對(duì)照，每個(gè)處理和對(duì)照皆設(shè)3個(gè)重復(fù)。置于28 ℃培養(yǎng)箱，接種24 h后分別觀察培養(yǎng)基及菌體的顏色反應(yīng)。

判斷依據(jù)[12]：0號(hào)和1號(hào)生理小種在TTZ液體培養(yǎng)基中，72 h內(nèi)菌絲全部變?yōu)榧t色；在固體培養(yǎng)基中，24 h菌體變?yōu)榧t色；3號(hào)生理小種在TTZ液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基中均不變紅。

1.4 鑒別寄主鑒定

1.4.1 鑒別寄主 選擇反應(yīng)相對(duì)穩(wěn)定的煙草品種NC1071、L8、N.nesophila、Florida301作抗病對(duì)照，小黃金1025作感病對(duì)照。0、1、2和3號(hào)生理小種在選定的鑒別寄主上的反應(yīng)見表1[14]。

表1 煙草黑脛病菌在鑒別寄主上的反應(yīng)Table1 The response of Phytophthora nicotianae on the different hosts

1.4.2 育苗 煙草種子于 25 ℃下用滅菌水黑暗浸泡約3～5 d，播于裝有高壓滅菌濕潤(rùn)土的盤中，置于24～28 ℃溫室培養(yǎng)，幼苗3片真葉時(shí)移栽于裝有滅菌砂壤土的塑料盆缽中（直徑12 cm）。

1.4.3 游動(dòng)孢子懸浮液的制備 向培養(yǎng)14～21 d的供試菌株培養(yǎng)基平板內(nèi)，加入 0.1%KNO3和 1%葡萄糖溶液，黑暗浸泡2 d，之后4 ℃處理40 min，25 ℃靜置20 min，調(diào)整游動(dòng)孢子濃度為1×104個(gè)/mL。

1.4.4 接種方法 用醫(yī)用注射器（5號(hào)針頭）吸取制備好的游動(dòng)孢子懸浮液，選取6～8葉期煙苗，莖基部注射菌液，置于25～28 ℃溫室，維持濕度90%，誘發(fā)病害。每處理4次重復(fù)，重復(fù)2株。每7 d調(diào)查病情，連續(xù)調(diào)查3次。

1.4.5 煙草黑脛病分級(jí)標(biāo)準(zhǔn) 0級(jí)：全株無病。

1級(jí)：莖部病斑不超過莖圍的1/2，或（和）半數(shù)以下葉片或頂葉輕度凋萎，或下部少數(shù)葉片出現(xiàn)病斑。

2級(jí)：莖部病斑超過莖圍的1/2，或（和）半數(shù)以上或部分腰葉以上葉片凋萎。

3級(jí)：莖部病斑環(huán)繞莖圍，或（和）2/3以上葉片或下一棚以上葉片凋萎。

4級(jí)：病株枯死。

2 結(jié) 果

30個(gè)菌株在TTZ固體培養(yǎng)基上接種24 h即可見接入的菌塊變?yōu)榧t色，并且隨著培養(yǎng)時(shí)間的加長(zhǎng)，紅色范圍逐漸擴(kuò)大，從培養(yǎng)基平板背面觀察，呈紅色圓斑（圖1）。30個(gè)菌株在TTZ液體培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h后，其菌體變?yōu)闇\紅，并且液體培養(yǎng)基亦呈淺紅色（圖2）。根據(jù)反應(yīng)[12]，排除供試菌株為3號(hào)生理小種的可能，即供試菌株為煙草黑脛病菌的0號(hào)或1號(hào)生理小種。

圖1 煙草黑脛病菌在TTZ固體培養(yǎng)基中的變色反應(yīng)Fig.1 The mycelial color of Phytophthora nicotianae on solid TTZ medium cultured after 24 h

圖2 煙草黑脛病菌在TTZ液體培養(yǎng)基中的變色反應(yīng)Fig.2 The mycelial color of Phytophthora nicotianae on liquid TTZ medium cultured after 72 h

由表2可看出，全部供試菌株在N.nesophila、Florida301和小黃金1025品種上的反應(yīng)分別表現(xiàn)為抗病、中抗和感病，但在NC1071和L8品種上的反應(yīng)表現(xiàn)有差異。其中，24個(gè)菌株在 NC1071和L8品種上的反應(yīng)皆表現(xiàn)為感病，病情指數(shù)分別為78.13～100和75.00～100。依據(jù)煙草黑脛病菌在鑒別寄主上的反應(yīng)（表1）與TTZ顏色反應(yīng)結(jié)果，初步鑒定24個(gè)菌株為1號(hào)生理小種，其余6個(gè)菌株在NC1071和L8品種上的反應(yīng)有所不同：BD-1菌株在2個(gè)品種上均為抗病，Xf-1、LC-2、XF-4三個(gè)菌株中感 NC1071中抗 L8，LC-5菌株中抗 NC1071感L8，ES-5菌株感NC1071中抗L8。根據(jù)TTZ顏色反應(yīng)結(jié)果，排除6個(gè)菌株為3號(hào)生理小種的可能，是否為2號(hào)生理小種還是其他致病型，尚待進(jìn)一步研究確定。不同菌株在鑒別寄主上的反應(yīng)如圖3。

3 討 論

供試的30個(gè)菌株在TTZ液體和固體培養(yǎng)基中的反應(yīng)皆為紅色。與TTZ液體培養(yǎng)基相比，在TTZ固體培養(yǎng)基中顏色變化更為明顯。不管是液體培養(yǎng)基中的菌絲，還是固體培養(yǎng)基中的菌絲，變色部分菌體菌絲的原生質(zhì)皆呈現(xiàn)紅色。John L McIntyre和G S Taylor[14]認(rèn)為菌體在TTZ培養(yǎng)中變?yōu)榧t色是與菌絲體中新陳代謝活躍的細(xì)胞中的脫氫酶有關(guān)。而王智發(fā)等[12]認(rèn)為，煙草黑脛病菌0號(hào)、1號(hào)生理小種可以使 TTZ培養(yǎng)基變色的基本機(jī)制是脫氫酶與TTZ發(fā)生氧化還原反應(yīng)生成了紅色物質(zhì)，且越是具有活性的菌體，變色愈深。由此說明，0號(hào)和1號(hào)生理小種的菌體內(nèi)存在與 TTZ發(fā)生氧化還原反應(yīng)的脫氫酶，而3號(hào)生理小種不具有可以與TTZ發(fā)生氧化還原反應(yīng)的脫氫酶。TTZ與脫氫酶作用的具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步的研究[12,15]。與生理小種間某些培養(yǎng)性狀差異和其他生理生化特性相比，TTZ顏色反應(yīng)有著較小的誤差和較明顯的可辨認(rèn)性，在煙草黑脛病菌生理小種的鑒定上起到了良好的輔助作用。

表2 煙草黑脛病菌在鑒別寄主上的反應(yīng)及生理小種類型Table2 The response of Phytophthora nicotianae on the different hosts

圖3 煙草黑脛病菌株在各寄主上的反應(yīng)Fig.3 The response of several strains of Phytophthora nicotianae on the different hosts

國(guó)內(nèi)外鑒別煙草黑脛病菌生理小種的寄主有很多，常用的有Florida301, L8, NC1071, Nicotiana.plunbaginifolia, Nicotiana.nesophila, Nicotiana.stocktonii, Nicotiana.nudicaulis, Burley21, Burley37,（L8×Burley21）F1等。有研究資料證明抗性來自N.longiflora的L8和抗性來自N.Plumbaginifolia的NC1071的抗性基因片斷是相似的，且都為顯性單基因遺傳，根、莖的抗性與正株抗性高度相關(guān)，且對(duì)0和1號(hào)生理小種的抗感反應(yīng)是穩(wěn)定的，因此不僅把這兩個(gè)材料作為田間出現(xiàn) 1號(hào)小種的指示寄主，同時(shí)也是區(qū)分0號(hào)和1號(hào)生理小種的標(biāo)準(zhǔn)鑒別寄主，而把莖接種技術(shù)作為標(biāo)準(zhǔn)接種方法[3]。N.nesophila對(duì)煙草黑脛病0號(hào)和1號(hào)生理小種的反應(yīng)是抗1號(hào)感0號(hào)生理小種，且它是野生種，基因比較穩(wěn)定，自然變異的可能性較小[8,13]。因此，本次試驗(yàn)選用NC1071、L8和N.nesophila作為區(qū)分0號(hào)和1號(hào)小種的鑒別寄主，小黃金1025作感病品種對(duì)照。

迄今為止，國(guó)內(nèi)外已報(bào)道的煙草黑脛病菌有 4個(gè)生理小種。1962年，Apple[16]在美國(guó)北卡羅萊納州發(fā)現(xiàn)了0號(hào)和1號(hào)生理小種，現(xiàn)0號(hào)和1號(hào)生理小種廣泛發(fā)生于世界煙草種植區(qū)；1973年P(guān)ringsloo G C等[17]在南非鑒定出煙草黑脛病菌 2號(hào)小種；1978年John L Mclntyre等[14]在美國(guó)康涅狄格州鑒定出3號(hào)小種。國(guó)內(nèi)報(bào)道的煙草黑脛病菌生理小種是0號(hào)和1號(hào)。朱賢朝等[6]于20世紀(jì)80年代研究發(fā)現(xiàn)，認(rèn)為我國(guó)主要煙區(qū)的煙草黑脛病菌，0號(hào)生理小種是優(yōu)勢(shì)種，亦有1號(hào)生理小種和1個(gè)致病型。其中，湖北省有1個(gè)菌系為1號(hào)生理小種，2個(gè)菌系為0號(hào)生理小種。1999年，李錫宏等[9]對(duì)湖北省恩施州煙草上分離得到的 46個(gè)菌系進(jìn)行生理小種鑒定，認(rèn)為46個(gè)菌系是0號(hào)生理小種，恩施煙區(qū)煙草黑脛病菌以0號(hào)生理小種占主導(dǎo)地位。

根據(jù)本研究，供試24個(gè)菌株為煙草黑脛病菌1號(hào)生理小種，占供試菌系的80%，與李錫宏等[9]1999年鑒定湖北恩施州煙草黑脛病菌基本是0號(hào)生理小種的結(jié)果發(fā)生了較大變化，是受品種基因型的影響，還是環(huán)境與遺傳基因共同作用的結(jié)果，還待進(jìn)一步研究探討。

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