王衛(wèi)鋒，晁江濤，龔達平，王 魯，李鳳霞，陳雅瓊,2，孫玉合*

(1.農(nóng)業(yè)部煙草類作物質(zhì)量控制重點開放實驗室，中國農(nóng)業(yè)科學院煙草研究所，青島 266101；2.中國農(nóng)業(yè)科學院研究生院，北京 100081)

簡單重復序列( simple sequence repeats，SSR)又稱微衛(wèi)星DNA、短串聯(lián)重復序列，一般為以 1～6個堿基為核心序列，首尾相連組成的串聯(lián)重復序列[1]。SSR位點廣泛存在于真核生物基因組中，不同遺傳材料在重復次數(shù)上的差異可導致 SSR位點長度的多態(tài)性，在SSR位點兩側(cè)有一段相當保守的單拷貝序列，根據(jù)此保守序列設(shè)計PCR引物能夠精確檢測出SSR位點的長度多態(tài)性。以SSR位點的長度多態(tài)性為基礎(chǔ)，利用PCR和電泳技術(shù)開發(fā)出的SSR分子標記具有對基因組覆蓋度好、數(shù)量豐富、多態(tài)性高、共顯性標記、實驗簡單以及重復性好等特點[2]。

SSR分子標記已在植物遺傳分析中得到廣泛應(yīng)用，如遺傳作圖、分子標記輔助選擇、群體遺傳分析以及分類學等方面，在花生、玉米、大麥[3-5]等作物中利用SSR標記已構(gòu)建了遺傳連鎖圖譜；Korzun等[6]利用SSR標記對小麥矮桿基因Rht8進行了定位；Prevost等[7]對34個馬鈴薯品種構(gòu)建了SSR指紋圖譜；SSR分子標記在小麥、大麥等作物的遺傳多樣性分析中也得到了成功應(yīng)用[8-9]。另外，在煙草中也利用SSR標記開展了相關(guān)研究，如范靜苑等[10]成功運用SSR分子標記分析了煙草CMV抗性基因的遺傳連鎖距離；Moon等[11]運用SSR分子標記分析了54份煙草屬材料的遺傳多樣性。

煙草分子標記研究多以RAPD和AFLP為主，主要應(yīng)用于野生種質(zhì)的抗病基因鑒定[12-18]，限于這些分子標記多態(tài)性較低，用其構(gòu)建煙草遺傳圖譜受到了很大限制[19-21]。對煙草基因組的測序極大地促進了煙草 SSR分子標記的開發(fā)，Bindler等[22]從Tobacco Genome Initiative（TGI）公布的煙草基因組序列信息中搜索到282個SSR分子標記，并利用這些標記構(gòu)建了第一張煙草的遺傳連鎖圖。在本研究中，通過軟件搜索絨毛狀煙草基因組序列，篩選到一批SSR位點，同時對其組成、分布及特征進行了分析，以期為開發(fā)新的煙草SSR分子標記提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

利用軟件SSRFINDER（http://www.maizemap.org/bioinformatics/SSRFINDER/）搜索絨毛狀煙草基因組DNA的序列數(shù)據(jù)，條件為：重復單元長度2～5 bp，重復次數(shù)為10～60。

2 結(jié) 果

2.1 SSR位點的數(shù)量與分布

利用軟件 SSRFINDER對絨毛狀煙草基因組DNA的序列數(shù)據(jù)進行搜索，共找到符合條件的SSR位點6441個，涉及5227個Scaffold，SSR位點的序列總長303963 bp（表1）。從SSR位點的數(shù)量上看，三堿基重復基元的數(shù)量最多，占49.6%；其次是二堿基重復基元，占45.2%；四堿基重復基元和五堿基重復基元數(shù)量很少，分別只占2.8%和2.4%（圖1）。二堿基重復基元、三堿基重復基元、四堿基重復基元和五堿基重復基元的 SSR位點的堿基總長分別是112678 bp、167889 bp、11616 bp和11780 bp，位點的平均長度分別是39 bp、53 bp、66 bp和75 bp。

從重復次數(shù)看，10～20重復的位點有4809個，占74.6%；21～30重復的位點有963個，占15.0%；31～40重復的位點有349個，占5.4%；41～50重復的位點有205個，占3.2%；51～60重復的位點有113個，占1.8%（圖2）。

2.2 重復單元的類型、數(shù)量及特征

在6441個SSR位點中，二堿基重復基元單元共出現(xiàn)11種類型，分別是CT（417個）、AG（400個）、TA（378個）、TC（373個）、GA（354個）、AT（312個）、TG（270個）、AC（229個）、CA（109個）、GT（71個）、CG（1個）；三堿基重復基元單元共出現(xiàn) 51種類型，數(shù)目最多的前 10種依次是GAA（304個）、TTC（295個）、AAG（224個）、TCT（218個）、AGA（215個）、TTG（198個）、ACA（184個）、CTT（177個）、AAC（163個）、GTT（156個）；四堿基重復基元單元共出現(xiàn)44種，數(shù)目最多的前10種依次是AAAG（16個）、ATAG（16個）、TATG（13個）、TTTA（12個）、ACAT（9個）、ATAC（7個）、TTTC（7個）、AAGA（6個）、AGAG(6個)、ATCT（6個）；五堿基重復基元單元共出現(xiàn)45種類型，數(shù)目最多的前10種依次是 CGGGA（23個）、TTTTC（20個）、AAAAG（14個）、GTCCC（14個）、CGTCC（10個）、ACAAT（5個）、AGAAA（4個）、GACGG（4個）、TCCCG（4個）、TTTTA（4個）（表2）。A、T、C、G在所有SSR位點中所占的比例分別為33.1%、33.4%、16.6%和16.9%（圖3），GC含量為33.5%。

表1 絨毛狀煙草基因組SSR位點的數(shù)量與分布Table1 Distribution of SSR loci in N.tomentosiformis Goodspeed genome DNA

圖1 4種重復單元的分布比例圖Fig.1 Distribution of four repeat motifs

圖2 重復次數(shù)分布圖Fig.2 Distribution of the number of repeats

圖3 SSR位點中四種堿基的比例Fig.3 Distribution of A, T,C and G in SSR loci

3 討 論

根據(jù)測序結(jié)果，絨毛狀煙草基因組大小為2.6Gb（待發(fā)表），本研究從中篩選 SSR總長約為300 kb，約占基因組的萬分之1.2，換句話說絨毛狀煙草基因組平均每400 kb出現(xiàn)一個SSR。而本研究并未計算單堿基重復基元和六堿基重復基元的SSR，所以SSR實際出現(xiàn)的頻率還會略高一些。不同物種間，SSR的數(shù)量、重復次數(shù)、重復單元以及在染色體上的分布均存在很大的差異[9]。在植物中，SSR的出現(xiàn)頻率與基因組大小、重復DNA所占比例呈負相關(guān)，而與轉(zhuǎn)錄區(qū)所占的比例、低拷貝序列的出現(xiàn)頻率成顯著正相關(guān)[23]。

?

絨毛狀煙草基因組的GC含量為38.9%，其中SSR序列的GC含量為33.5%，明顯低于全基因組的GC含量。SSR序列顯示出顯著的堿基偏好性，A/T的頻率顯著高于G/C。二、三堿基重復基元的SSR共6107個，占SSR總體的94.8%。而（CG）n、（GTG）n、（GTC）n、（GCA）n、（CGC）n分別只出現(xiàn)了1次，說明這些重復單元的SSR在絨毛狀煙草基因組中非常少見。從總體來看，各種重復類型的 SSR位點都存在著長度越長出現(xiàn)的頻次越少的趨勢。目前，對于植物SSR序列信息的分析，大多來源于EST數(shù)據(jù)[24-30]，由于EST-SSR來自于轉(zhuǎn)錄區(qū)域，一般保守性較高，通用性好。Cho[31]等人對水稻的研究結(jié)果表明，來源于基因組的SSR比來源于EST的SSR具有更豐富的多態(tài)性。研究發(fā)現(xiàn)，當SSR長度大于等于20 bp時，不同品種間顯示出較高的多態(tài)性[32]，而且高級基元的SSR多態(tài)性比低級基元的低[33]。在這6441個SSR位點中，二、三、四、五重復基元SSR位點的平均長度分別為39 bp、53 bp、66 bp和75 bp，其中二、三堿基重復基元的總和占總體的94.8%，表明這些SSR具有較高的利用價值。用PRIMER5.0對這6441個SSR設(shè)計引物，其中6020可獲得滿足條件的引物。至于哪些引物可用于開發(fā)新的煙草 SSR分子標記還有待進一步研究。

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