辛伐他汀對 THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞膽固醇代謝和 SR-A表達的影響

李晨光，羅俊生，馮 旭，霍小川，關 寧

(遼寧醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院，遼寧錦州 121001)

動脈粥樣硬化(AS)是一個復雜的病理過程，巨噬細胞源性泡沫細胞的形成是其顯著特征[1]。清道夫受體介導的氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)的蓄積是 AS發(fā)生、發(fā)展中泡沫細胞形成的關鍵[2]。研究表明，他汀類藥物除具有顯著的降脂作用外，還具有獨特的心血管防治作用，如改善內皮細胞功能、抗炎、抑制 LDL的氧化修飾、抑制清道夫受體表達等[3]。然而關于他汀類藥物對清道夫受體介導的THP-1巨噬細胞脂質蓄積的影響及機制仍不甚明確。2010年 6～12月，我們觀察了不同濃度辛伐他汀對人單核源性巨噬細胞泡沫化的影響，并對此類藥物的抗 AS機理進行了初步探討。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 THP-1單核巨噬細胞株(中國科學院上海細胞生物學研究所)，胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基(美國 GIBCO公司)，ox-LDL(北京協(xié)生生物科技有限公司)，油紅 O和佛波酯(PMA)(Sigma公司);淋巴細胞分離液(天津市灝洋生物公司)，辛伐他汀(輝瑞制藥)，BCA蛋白含量測定試劑(北京 Applygen基因技術有限公司);SR-A羊抗人和 β-actin兔抗人一抗，辣根過氧化物酶標記驢抗羊和羊抗兔二抗(Santa Cruz公司)。其他試劑均為進口或國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 細胞的培養(yǎng)及實驗分組 THP-1細胞生長于含 10%滅活新生胎牛血清、1×108U/L青霉素的RPMI 1640完全培養(yǎng)基中，置 37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。每次實驗前用 150 nmol/L PMA孵育 24 h，使其誘導分化為巨噬細胞。在每次實驗前將巨噬細胞密度調整為 1×106個 /孔，加入 6孔培養(yǎng)板中。實驗細胞分為 5組，即對照組、ox-LDL組、辛伐他汀按濃度分低中高 3組(1、10、100μmol/L組)。ox-LDL組加入 ox-LDL(終濃度為 100 mg/L)處理 24 h;辛伐他汀處理組按不同濃度辛伐他汀處理巨噬細胞 2 h后，加入 ox-LDL(終濃度為 100 mg/L)處理 24 h，誘導巨噬細胞泡沫化;對照組不予處理。

1.2.2 SR-A蛋白的檢測 采用 Western blot法。上述各組細胞經(jīng) 24 h處理后用細胞刮刀收集至 EP管內。用 TBS漂洗后加入 RIPA緩沖液(1%NP-40、0.5%脫氧膽酸鈉、1%SDS、0.1%PMSF)裂解細胞，考馬斯亮藍法測定蛋白質濃度。加熱變性，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉膜，5%脫脂奶粉封閉過夜，加入 1∶200 SR-A羊抗人一抗，雜交 2 h。TBST洗膜后加入 1∶15 000驢抗羊二抗 ，溫育 1 h，TBST洗膜后進行 BCIP/NBT顯色，采用 Chemi-genius凝膠成像系統(tǒng)分析目的蛋白的表達量。人 β-actin作為內參，一抗是 1∶500兔抗人 β-actin抗體，二抗是1∶15 000羊抗兔二抗。

1.2.3 油紅 O染色和脂質染色的半定量分析 將貼壁的巨噬細胞以 PBS沖冼3次，放在 4℃、10%甲醛中固定 10 min，用油紅 O染色、水冼 5 min，60%異丙醇中放置 5 min，新過濾的油紅 O染色 10 min，60%異丙醇分化 5 min，水洗 5 min，Mayer氏苯木精明礬染液染色 5 min，1%HCl分色及反藍后，水洗 5 min并照相。按 Wada方法[4]進行脂質染色的半定量分析，即根據(jù)細胞脂滴的面積進行細胞分類。如果細胞脂滴的面積小于細胞核的面積記為“-”，細胞脂滴的面積等于或大于細胞核的面積記為“+”，此即為油紅 O染色細胞，每孔隨機計數(shù)一個視野(×400)的細胞。

1.2.4 高效液相色譜分析(HPLC) 待細胞處理結束后，棄去培養(yǎng)基，PBS洗 3遍，加入 1 ml生理鹽水重新稀釋細胞，反復凍融，冰浴中超聲裂解細胞。高效液相色譜法參照 Cullen等[5，6]的方法，測定細胞游離膽固醇(FC)和膽固醇酯(CE)的含量。膽固醇用外標法峰面積定性定量。色譜條件為色譜柱:C18;流動相 ∶異丙醇 ∶正庚烷 ∶乙腈 (35∶12∶52，v/v)，非梯度洗脫;流速:1 ml/min;檢測波長:210 nm，檢測到第 8分鐘;柱溫:20℃。用 CE酶水解 CE得TC量，以 HPLC測定膽固醇并定量，以 TC量減去FC量代表CE量。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用 SPSS13.0統(tǒng)計軟件，結果以±s表示，兩組間比較采用 t檢驗及方差分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組油紅 O染色陽性細胞變化 ox-LDL誘導24 h后，油紅 O染色結果顯示:正常對照組細胞形態(tài)呈橢圓形或不規(guī)則形狀，油紅 O染色陽性細胞少，細胞核藍染，胞質略顯紅色;ox-LDL誘導組陽性細胞遍布，胞質大量紅染，細胞核藍染，且細胞體積部分增大，細胞呈圓形或不規(guī)則形。通過比較陽性細胞數(shù)量可以看出，陽性細胞率由(8.65±1.40)%增加到(86.70±0.89)%;HPLC檢測結果顯示:ox-LDL誘導組的 CE與 TC之比大于 60%。以上結果說明巨噬細胞泡沫化效果明顯。見表1。

表1 不同濃度辛伐他汀處理后巨噬細胞油紅 O染色陽性細胞的相對含量(%，±s)

表1 不同濃度辛伐他汀處理后巨噬細胞油紅 O染色陽性細胞的相對含量(%，±s)

注:與對照組比較，*P＜0.01;與 ox-LDL組比較，#P＜0.01

組別 n 陽性細胞率對照組 5 8.65±1.40 ox-LDL組 5 86.70±0.89*ox-LDL組 +低劑量辛伐他汀組 5 75.34±0.46#ox-LDL組 +中劑量辛伐他汀組 5 45.68±1.35#ox-LDL組 +高劑量辛伐他汀組 5 14.21±2.12#

2.2 辛伐他汀處理后細胞內 CE變化的量效關系辛伐他汀處理后，油紅 O染色陽性細胞比例明顯減少。當藥物濃度在 100μmol/L時，陽性細胞比例接近正常細胞。HPLC檢測結果顯示，CE/TC值隨著辛伐他汀濃度的增加而降低，由(64.34±0.86)%降至(24.21±1.16)%(P＜0.01)，說明辛伐他汀預處理細胞可以減少 CE在細胞內聚集，有效抑制細胞泡沫化。見表2。

表2 不同濃度辛伐他汀處理后細胞中CE/TC的變化(%，±s)

表2 不同濃度辛伐他汀處理后細胞中CE/TC的變化(%，±s)

注:與對照組比較，*P＜0.01;與 ox-LDL組比較，#P＜0.01

組別 n CE/TC變化對照組 5 19.23±0.95 ox-LDL組 5 64.34±0.86*ox-LDL組 +低劑量辛伐他汀組 5 57.21±0.57#ox-LDL組 +中劑量辛伐他汀組 5 46.83±0.64#ox-LDL組 +高劑量辛伐他汀組 5 24.21±1.16#

2.3 細胞 SR-A蛋白表達的情況 通過 Western blot檢測顯示，對照組細胞中 SR-A蛋白表達量較少(0.82±0.23)，當巨噬細胞經(jīng) ox-LDL誘導分化成泡沫細胞過程中，SR-A蛋白水平(1.96±0.42)顯著上調(P＜0.01)。經(jīng)辛伐他汀處理后，SR-A蛋白的表達量值隨著辛伐他汀濃度的增加而降低，當濃度降到 100μmol/L，SR-A蛋白表達水平(0.79±0.12)接近正常巨噬細胞。見圖1。

圖1 SR-A蛋白表達量

3 討論

巨噬細胞源性泡沫細胞的形成是一個多環(huán)節(jié)的復雜過程。一方面，巨噬細胞對 LDL起修飾作用。巨噬細胞通過細胞內多種酶(如脂肪氧化酶)和活性氧(如超氧負離子)作用于 LDL而產(chǎn)生一定程度的氧化修飾。巨噬細胞大量吞噬被自身細胞核金屬離子修飾的 LDL，表現(xiàn)出一定的泡沫化傾向[7，8]。另一方面，巨噬細胞通過清道夫受體，CD36受體或其他受體的作用，對 ox-LDL的大量吞噬促成了巨噬細胞源性泡沫細胞的形成[9]。本實驗用 ox-LDL孵育巨噬細胞，當終濃度為 100 mg/L時，泡沫化效果較好，泡沫化率接近 90%。

SR-A是一種跨膜糖蛋白受體，主要表達于巨噬細胞、血管平滑肌細胞和內皮細胞，ox-LDL作為一種重要的配體與之結合后，在 AS的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。巨噬細胞吞噬脂質轉變?yōu)榕菽毎窃缙?AS形成過程中的關鍵環(huán)節(jié)，SR-A是巨噬細胞膜上的糖蛋白，其不受細胞內膽固醇的負反饋調節(jié)，能無限制地吸收細胞外的脂質進入細胞內，使巨噬細胞轉變?yōu)榕菽毎鸞10]。本研究顯示，在 ox-LDL刺激巨噬細胞 24 h后形成的泡沫細胞中，SR-A蛋白表達含量增加，提示 ox-LDL對 SR-A受體表達的影響可能是通過增強 SR-A基因轉錄實現(xiàn)的，即通過促進受體表達量來增強對其自身的結合和攝取。

他汀類藥物是目前臨床上應用最為廣泛的調脂藥物，既可以降低血低密度脂蛋白膽固醇水平，也可以明顯減少冠狀動脈心臟病等心血管疾病的發(fā)病率和死亡率，從而奠定了他汀類藥物在動脈粥樣硬化防治中的重要地位。大量的臨床和基礎研究證實，他汀類藥物的臨床意義除了調脂作用，還能發(fā)揮多種非膽固醇依賴的直接生物學效應，包括抗炎、改善血管內皮細胞功能、抑制平滑肌增殖、穩(wěn)定斑塊等。其中抗炎作用對抑制動脈粥樣硬化的形成、降低心血管事件的發(fā)生率具有重要意義。本實驗采用 ox-LDL處理人 THP-1單核源性巨噬細胞建立泡沫細胞模型，采用不同濃度的辛伐他汀進行干預。結果顯示，辛伐他汀處理泡沫細胞后，油紅 O染色提示細胞內脂滴較對照組明顯減少，細胞內的 CE顯著減少，CE/TC值隨著辛伐他汀濃度的增加而降低(P＜0.01)，說明辛伐他汀預處理細胞可以減少 CE在細胞內聚集，有效抑制細胞泡沫化，且 SR-A蛋白表達量隨辛伐他汀濃度增高而降低。

綜上所述，辛伐他汀的抗 AS作用除已知的調脂作用外，還與抑制清道夫受體 SR-A表達、降低巨噬細胞攝取膽固醇、抑制巨噬細胞泡沫化有關。

[1]De Boer OJ，van der Wal AC，Becker AE.Atherosclerosis，inflammation，and infection[J].J Pathol，2000，190(3):237-243.

[2]Lam MC，Tan KC，Lam KS.Glyeoxidized low-density lipoprotein regulates the expression of scavenger receptors in THP-1 macrophages[J].Atherosclerosis，2004，177(2):313-320.

[3]Raja SG，Dreyfus GD.Statins:much more than just a lipid-lowering therapy[J].Indian Heart J，2004，56(3):204-209.

[4]Wada Y，Sugiyama A，Yamamoto T，et al.Lipid accumulation in smooth muscle cells under LDL loading is independent of LDL receptor pathway and enhanced by hypoxic conditions[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol，2002，22(10):1712-1719.

[5]Cullen P，F(xiàn)obker M，Tegelkamp K，et al.An improved method for qualification of cholesterol and cholesterol esters in human monocytederived macrophages by high performance liquid chromatography with identification of unassigned cholesteryl esters species by means of secondary ion mass spectrometry[J].JLipid Res，1997，38(2):401-409.

[6]王佐，李全忠，楊向東，等.高效液相色譜分析氧化型低密度脂蛋白處理 U937細胞內膽固醇及膽固醇酯[J].中國動脈粥樣硬雜志，1998，6(4):317-320.

[7]Heinecke JW，Rosen H，Chait A.Iron and copper promotemodification of low density lipoprotein by human arterial smooth muscle cells in culture[J].JClin Invest，1984，74(5):1890-1894.

[8]McNally AK，Chisolm GM 3rd，Morel DW，et al.Activated human monocytes oxidize low-density lipoprotein by a lipoxygenase-dependent pathway[J].J Immunol，1990，145(1):254-259.

[9]Parthasarathy S，Printz DJ，Boyd D，et al.Macrophage oxidation of low density lipoprotein generates a modified form recognized by the scavenger receptor[J].Arteriosclerosis，1986，6(5):505-510.

[10]Svensson L，Noren K，Wiklund O，et al.Inhibitory effects of N-acetylcysteine on scavenger receptor class A expression in human macrophages[J].J Intern Med，2002，251(5):437-446.