攜帶Foxp3基因慢病毒載體的構建

陳 春，李永翔*，羅慶禮

(1安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院，合肥230032;2安徽醫(yī)科大學教育部省部共建重要遺傳病基因資源利用重點實驗室)

Fox是脊椎動物叉頭樣轉錄因子的總稱，通常與細胞生長發(fā)育的調控有關［1］。Foxp3是叉頭樣轉錄因子P亞家族成員，特異性表達于CD4+CD2+5調節(jié)性T細胞(Tregs)，通過反轉錄病毒轉染Foxp3基因能促使初始T細胞向CD4+CD2+5Tregs分化，因此其被看作參與CD4+CD2+5Tregs 分化的重要分子［2］。2010年5～12月，我們成功將Foxp3基因構建在慢病毒表達載體PWPXL-MOD上，并與包裝慢病毒所必需的相關質粒共轉染人胚腎293T細胞，成功收獲了攜帶Foxp3的慢病毒載體，并對病毒進行純化、濃縮，為體外獲得CD4+CD2+5Tregs奠定基礎?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 Foxp3基因質粒(Genescript公司合成)，PWPXL-MOD載體、四種包裝質粒載體(pRsv-REV、pMDlg-pRRE、pMD2G、干擾質粒，上海奧鵬生物有限公司)，Taq DNA聚合酶、T4連接酶(TOYOBO公司)，限制性內切酶(Takara公司)，凝膠回收試劑盒、質粒抽提試劑盒(Axygen公司)，DNA marker(DL2000和DL3000，大連寶生物公司)。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。人胚腎293T細胞株購自ATCC公司，大腸桿菌菌株DH5α、胎牛血清以及胰蛋白酶購自Invitrogen公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 FoxP3基因片段制備及目的片段克隆與鑒定 Foxp3基因兩端分別插入的酶切位點為MluⅠ和EcoRⅠ。用EcoR V酶切pUC57載體，將其與目的基因片段采用T4 DNA連接酶進行連接反應，4℃，連接過夜;連接產(chǎn)物轉化感受態(tài)DH5α，涂布氨芐青霉素抗性瓊脂糖(LB)平板培養(yǎng)基，37℃過夜培養(yǎng)。用MluⅠ和EcoRⅠ進行雙酶切、測序鑒定，測序結果與GenBank中的基因序列進行對比。

1.2.2 攜帶Foxp3基因的慢病毒表達載體的構建 對測序正確的酶切產(chǎn)物進行DNA凝膠回收及純化，分別用MluⅠ和EcoRⅠ酶切pUC57-Foxp3載體和PWPXL-MOD慢病毒表達載體，參考Cao等［3］的方法構建Foxp3與綠色熒光蛋白(GFP)共表達的慢病毒載體。抽提質粒，酶切、測序鑒定。測序結果與GenBank中的基因序列進行對比。

1.2.3 病毒包裝、純化及滴度測定 制備慢病毒穿梭質粒及其輔助包裝原件載體質粒，四種質粒載體，其中 pRsv-REV、pMDlg-pRRE、pMD2G含有病毒包裝所必須的元件，干擾質粒能表達GFP。分別進行高純度無內毒素抽提，采用磷酸鈣沉淀法共轉染293T細胞，轉染8 h后更換為完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后，收集富含慢病毒顆粒的細胞上清液，超離心純化獲得高滴度的慢病毒濃縮液，用逐孔稀釋滴度法測定。感染293T細胞后用流式細胞術檢測病毒滴度。

2 結果

2.1 Foxp3基因片段擴增結果 將目的基因連接后的重組質粒經(jīng)MluⅠ和EcoRⅠ酶切后，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外線下除了相應載體條帶外分別可見2 710、1 275 bp的DNA片段，與理論計算片段一致(詳見圖1)。測序結果與GenBank中的基因序列比對顯示序列一致。

圖1 MluI和EcoRI酶切后pUC57載體

2.2 Foxp3基因與EGFP共表達載體的酶切及測序鑒定結果 用MluⅠ和EcoRⅠ雙酶切克隆載體，1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外線下除了相應載體條帶外分別可見2 283、1 275 bp的DNA片段，與理論計算片段一致(詳見圖2)。測序結果與GenBank中的基因序列比對顯示序列一致。

2.3 病毒滴度測定結果 病毒感染293T細胞后，流式細胞術測定的病毒滴度為3.3×108IU/ml。

圖2 MluⅠ和EcoRⅠ雙酶切后Foxp3基因與EGFP共表達載體

3 討論

CD4+CD2+5Tregs是抑制性T細胞的一種亞群，其在大、小鼠和健康人體中約占外周CD4+T細胞的5% ～10%。有學者發(fā)現(xiàn)［4］，將清除了 CD4+CD2+5的CD4+T細胞輸注給nu/nu小鼠，會引起器官特異性自身免疫性疾病的發(fā)生，但若同時輸注CD4+CD2+5Tregs即可避免。CD4+CD2+5Tregs不僅能夠抑制急性排斥反應同時也具有抑制慢性排斥反應、延長移植物存活時間的作用。在維持外周耐受、防止自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用［4，5］。

Foxp3基因在CD4+CD2+5Tregs的發(fā)育和功能中起著決定性作用。人類同源的Foxp3基因突變可引起免疫失調、多發(fā)性內分泌疾病、腸病、x染色體性聯(lián)綜合征(IPEX)［6］。Walker等［7］通過轉基因技術人為的使CD4+CD2－5T細胞表達Foxp3，發(fā)現(xiàn)這些轉染后的細胞獲得了Tregs的表型和功能。

Foxp3基因的編碼產(chǎn)物為48 kD的蛋白質scurfin，其以IL-2依賴的受體作為轉錄阻遏物，但是體內確切的靶點仍不清楚。在scurfin缺陷的突變小鼠內可發(fā)生CD4+T細胞相關淋巴細胞增生病。外周T細胞可以通過轉基因或者轉化生子因子-β(TGF-β)誘導表達Foxp3而獲得具有 CD4+CD2+5Tregs功能［8，9］。輸注Treg利用其強大的免疫調節(jié)作用誘導同種異體移植免疫耐受成為一種新的免疫耐受誘導措施［10］。

以病毒介導的基因轉移成為目前最主要的基因轉移方法之一，但反轉錄病毒載體無法高效轉染非分裂期細胞，而慢病毒載體不但可以感染非分裂期細胞，還能將較大的目的基因片段整合到宿主細胞中，并能夠持續(xù)穩(wěn)定的表達目的基因。故成功構建慢病毒載體，對體外獲得CD4+CD2+5Tregs有著重要意義。

研究中我們選擇慢病毒作為載體，因為CD4+CD2－5T細胞增殖能力低，而慢病毒載體是在人類免疫缺陷病毒-1(HIV-1)基礎上改造而成的病毒載體系統(tǒng)，它能高效的將目的基因導入動物和人的原代細胞或細胞系中。慢病毒載體基因組是正鏈RNA，其進入細胞后，在細胞質中被其自身攜帶的反轉錄酶反轉為DNA，形成DNA整合前復合體，進入細胞核后，DNA整合到細胞基因組中。整合后的DNA轉錄mRNA，回到細胞質中，表達目的蛋白。因目的基因整合到宿主細胞基因組中，并隨細胞基因組的分裂而分裂，因此慢病毒載體介導的基因表達作用持續(xù)且穩(wěn)定。本研究中我們得到了高滴度的慢病毒載體，為體外獲得CD4+CD2+5Tregs奠定了基礎。

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［3］曹江，陳翀，徐開林，等.攜帶鼠Foxp3基因的自身失語型慢病毒載體的構建及表達［J］.四川大學學報醫(yī)學版，2009，40(2):199-202.

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