RP-HPLC法測(cè)定清肺抑火丸中芒果苷的含量

張麗珍，周之榮（廣東藥學(xué)院，廣州市 510006）

清肺抑火丸是由黃芩、梔子、知母、浙貝母、黃柏等10味藥材制成的中藥成方制劑，具有清肺止咳、化痰通便之功效。臨床用于治療痰熱阻肺所致的咳嗽、痰黃稠黏、口干咽痛、大便干燥。該產(chǎn)品現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)[1]采用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定黃芩苷的含量，有文獻(xiàn)報(bào)道薄層掃描法測(cè)定清肺抑火丸中小檗堿和菝葜皂苷元的含量[2]和HPLC法測(cè)定白花前胡甲素[3]及大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚4種蒽醌類成分的含量[4]，但芒果苷的含量測(cè)定未見文獻(xiàn)報(bào)道。為進(jìn)一步評(píng)價(jià)該制劑的質(zhì)量，筆者建立了清肺抑火丸中芒果苷含量測(cè)定的反相高效液相色譜（RP-HPLC）法，并證明該法具有分離效果好、靈敏、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，可用于清肺抑火丸的質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

Agilent 1100 HPLC儀、Agilent 1100系列雙元泵、Agilent 1100可變波長(zhǎng)檢測(cè)器、Agilent 1100/化學(xué)工作站（美國(guó)安捷倫公司）；KQ-400KDB型高功率數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，工作頻率100 kHz，輸出功率400 W）。

芒果苷對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：111607-200402）；清肺抑火丸（甘肅佛仁制藥科技有限公司，批號(hào)：20100702、20100901、20100704、20100501、20090504，規(guī)格：每袋6 g）；乙腈為色譜純，水為雙蒸水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取芒果苷對(duì)照品10.2 mg，置于100 mL容量瓶中，加稀乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品貯備液（芒果苷濃度為102 μg·mL－1）。

2.1.2 供試品溶液的制備 取清肺抑火丸適量，研細(xì)，取約0.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇25 mL，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用稀乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，棄去初濾液，續(xù)濾液0.45 μm濾膜過濾，作為供試品溶液。

2.1.3 陰性對(duì)照溶液的制備 取處方組成中除知母外的其余成分，制成不含知母的陰性對(duì)照，按“2.1.2”項(xiàng)下的制備方法處理，作為陰性對(duì)照溶液。

2.2 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Diamonsil-C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm，美國(guó)迪馬公司）；流動(dòng)相：乙腈-0.2%磷酸水溶液（13∶87）；流速：1.0 mL·min－1；檢測(cè)波長(zhǎng)：258 nm；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：35 ℃。分別取對(duì)照品溶液（芒果苷濃度為25.5μg·mL－1）、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液10μL，注入HPLC儀。結(jié)果，理論板數(shù)以芒果苷峰計(jì)算≥6000；芒果苷峰的拖尾因子為0.95，保留時(shí)間約為16.5 min，芒果苷峰與其他組分峰的分離度＞1.5；陰性對(duì)照不干擾樣品測(cè)定。色譜見圖1。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察 分別吸取0.5、1.0、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0 mL的芒果苷對(duì)照品貯備液，加稀乙醇稀釋成芒果苷濃度為5.1、10.2、20.4、25.5、30.6、40.8、51.0 μg·mL－1的溶液。依次進(jìn)樣10μL，每個(gè)濃度測(cè)定3次以上。以峰面積（A）對(duì)對(duì)照品溶液系列濃度（C）進(jìn)行回歸，得回歸方程A＝42.11C－16.06（r＝0.9997）。結(jié)果表明，芒果苷檢測(cè)濃度在5.1～51.0 μg·mL－1范圍內(nèi)與峰面積積分值線性關(guān)系良好。

2.3.2 精密度試驗(yàn) 取濃度為25.5μg·mL－1的芒果苷對(duì)照品溶液10μL，連續(xù)測(cè)定5次。結(jié)果，其峰面積的平均值為1074.0，RSD＝0.39%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液（批號(hào)：20100702）于0、2、4、6、8、12 h 分別進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積。結(jié)果，芒果苷峰面積的平均值為956.0，RSD＝1.47%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)（20100702）樣品適量，共6份，按“2.1.2”方法提取、“2.2”項(xiàng)下方法測(cè)定。結(jié)果，芒果苷平均含量為1.170 mg·g－1，RSD＝0.54%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取同一批號(hào)（20100702）樣品適量，共6份，加入相應(yīng)量的芒果苷對(duì)照品，照“2.1.2”方法處理并按照“2.2”項(xiàng)下方法測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，芒果苷平均加樣回收率為99.6%，RSD＝1.33%，詳見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 1 Results of recovery tset（n＝6）

2.4 樣品含量測(cè)定

取清肺抑火丸樣品5批，照“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別精密吸取對(duì)照品溶液（25.5μg·mL－1）與供試品溶液各10μL，注入HPLC儀，按照“2.2”項(xiàng)下方法測(cè)定，計(jì)算樣品中芒果苷的含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果Tab 2 Results of content determination of samples

3 討論

知母是百合科植物知母的干燥根莖，為2010年版《中國(guó)藥典》收載的常用中藥之一，味甘、苦，性寒，入肺、胃、腎經(jīng)，具有清熱瀉火、生津潤(rùn)燥之功，為方中主藥。其化學(xué)成分主要有甾體皂苷、雙苯吡酮類、木脂素類、有機(jī)酸類、生物堿、黃酮類、多糖類、微量元素及大量的黏液質(zhì)等[5]，其中芒果苷是知母中主要的雙苯吡酮類成分，含量可達(dá)0.7%[6]，具有抗炎和減輕哮踹作用、抗病毒和抗腫瘤作用、抗氧化作用、免疫調(diào)節(jié)作用[7]，因此筆者將芒果苷作為清肺抑火丸含量測(cè)定的指標(biāo)性成分。

本試驗(yàn)曾考察了不同的提取溶劑（甲醇、乙醇、三氯甲烷）、不同提取方法（回流、超聲）、不同的超聲提取時(shí)間（20、30、40、50、60 min）對(duì)芒果苷含量的影響。結(jié)果表明，稀乙醇超聲提取30 min，直接過濾制備的供試品溶液，芒果苷的提取率高、分離效果好。

芒果苷具有一定的弱酸性。試驗(yàn)中考察了不同比例的乙腈-磷酸水溶液對(duì)分離的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙腈-磷酸水溶液（13∶87）為流動(dòng)相，能實(shí)現(xiàn)芒果苷與其他組分的有效分離，芒果苷峰形好，分離度＞1.5。試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)柱溫對(duì)芒果苷分離測(cè)定影響較大，在室溫下測(cè)定結(jié)果不穩(wěn)定，當(dāng)柱溫選擇35℃時(shí)，得到滿意結(jié)果。因此，選用如前所述的色譜條件。

綜上所述，本試驗(yàn)采用RP-HPLC法中的離子抑制色譜法測(cè)定芒果苷的含量，方法學(xué)驗(yàn)證表明，其精密度、穩(wěn)定性、加樣回收率和重復(fù)性均能滿足定量的要求。故本方法可用于清肺抑火丸的質(zhì)量控制，建議相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)升級(jí)時(shí)增加芒果苷的含量測(cè)定。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì)編.中華人民共和國(guó)藥典（一部）[S].2010年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：1116.

[2]衛(wèi)恒巧，李作平，崔秀彥，等.薄層掃描法測(cè)定清肺抑火丸中小檗堿和菝葜皂苷元的含量[J].河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1992，（4）：199.

[3]黃瑞紅，楊慧文.RP-HPLC法測(cè)定清肺抑火丸中白花前胡甲素的含量[J].中國(guó)藥房，2010，21（27）：2556.

[4]葉秀金，宋粉云.HP LC法測(cè)定清肺抑火丸中大黃的四種成分的含量 [J].中藥新藥與臨床藥理，2010，21（6）：646.

[5]李習(xí)平，石繼連，胡還甫.知母的研究概況[J].岳陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，25（1）：90.

[6]楊麗榮.知母的化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)中醫(yī)中藥分冊(cè)，2002，24（4）：207.

[7]王穎異，郭寶林，張立軍.知母化學(xué)成分的藥理研究進(jìn)展[J].科技導(dǎo)報(bào)，2010，28（12）：110.