石榴皮鞣質(zhì)的急性毒性研究

邱紅梅，賴舒，尚京川，周岐新#（.重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理教研室/重慶市生物化學(xué)與分子藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶市 40006；.重慶醫(yī)科大學(xué)藥物分析教研室，重慶市 40006）

石榴皮為石榴科植物石榴的干燥果皮。實(shí)驗(yàn)證明，石榴皮提取物有明顯的對(duì)抗實(shí)驗(yàn)性胃損傷作用，且其胃黏膜保護(hù)作用可能與石榴皮提取物中的主要成分單寧有關(guān)。藥理研究證明，從桃金娘科植物蒲桃皮水浸液中提取的含量為13.4%的單寧對(duì)鹽酸-乙醇誘導(dǎo)的大鼠胃黏膜損傷有明顯的保護(hù)作用[1]；石榴皮鞣質(zhì)（單寧含量約73%）對(duì)實(shí)驗(yàn)性胃損傷也有明顯的保護(hù)作用[2]。但也有文獻(xiàn)報(bào)道單寧能導(dǎo)致人肝壞死[3]；實(shí)驗(yàn)研究也證實(shí)其可引起小鼠肝臟毒性[4]。因此，在開(kāi)發(fā)石榴皮提取物的潛在應(yīng)用時(shí)，需要評(píng)估其安全性。為此，筆者對(duì)石榴皮提取物石榴皮鞣質(zhì)進(jìn)行了初步的急性毒性實(shí)驗(yàn)研究。

1 儀器與材料

1.1 儀器

SZ297型自動(dòng)三重純水蒸餾器（上海亞榮生化儀器廠）；保溫干燥箱（重慶實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠）；A2000S型電子分析天平（德國(guó)Sartorius公司）；721型分光光度計(jì)（上海第三分析儀器廠）；電熱恒溫水浴鍋（北京長(zhǎng)安科學(xué)儀器廠）。

1.2 試藥

干燥石榴皮（徐州醫(yī)藥有限公司中藥飲片廠，批號(hào)：070911，參照丙酮提取、醋酸乙酯萃取法從石榴皮中提取鞣質(zhì)，由重慶醫(yī)科大學(xué)化學(xué)教研室尚京川教授提供，其總單寧含量為73%）。實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純。

1.3 動(dòng)物

健康昆明種小鼠，♀♂兼半，體重20～25 g，由重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供（動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（渝）200220001）。

2 方法

2.1 石榴皮鞣質(zhì)混懸液的制備

精密稱取石榴皮鞣質(zhì)10.27 g，置于研缽中，10 mL0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）溶液分多次加入，每次加入后盡量研磨石榴皮鞣質(zhì)至細(xì)膩，即得濃度為102.7%的石榴皮鞣質(zhì)混懸液。避光保存，備用。用前搖勻，并將其作為預(yù)實(shí)驗(yàn)中的最大給藥濃度。

2.2 石榴皮鞣質(zhì)引起小鼠死亡的最小致死量（Dmin）和最大致死量（Dmax）的確定

單寧的半數(shù)致死量（LD50）為6000 mg·kg-1，石榴皮經(jīng)丙酮提取得到的石榴皮鞣質(zhì)含單寧73%，故選用9只小鼠（♀♂兼半），分為2739、8219、24657 mg·kg-1劑量給藥，給藥容積為0.2 mL·10 g-1，觀察小鼠在給藥后7 d內(nèi)死亡情況，得到Dmin＝8219 mg·kg-1。在Dmin的基礎(chǔ)上遞減劑量，得到D0%＝4609.81 mg·kg-1，再在Dmin的基礎(chǔ)上給藥，連續(xù)劑量增加的系數(shù)是1.15，直到小鼠全部死亡得到Dmax，即D100%＝15963 mg·kg-1。

2.3 分組和給藥

根據(jù)公式：1/K＝（N－1）×（Dmax－Dmin）/2進(jìn)行分組（式中：1/K為組間比值；N為分組數(shù)）。在D100%和D0%之間取7組。將D100%和D0%的值換算成對(duì)數(shù)，再按等對(duì)數(shù)距離分組。70只小鼠隨機(jī)均分為 A、B、C、D、E、F、G 7個(gè)組，劑量分別為 15963.00、12978.00、10551.12、8578.25、6974.19、5670.07、4609.81 mg·kg-1。

2.4 觀察指標(biāo)

2.4.1 觀察小鼠的不良反應(yīng)和死亡情況 給藥當(dāng)天密切觀察給藥后小鼠的反應(yīng)情況，然后每天上午8時(shí)、下午2時(shí)各觀察1次，持續(xù)觀察7 d小鼠的不良反應(yīng)和死亡情況，記錄各組小鼠死亡情況。

2.4.2 肝組織病理形態(tài)學(xué)觀察 各組存活小鼠，給藥24 h后斷頭處死，分離肝臟組織，固定切片，HE染色鏡檢。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 石榴皮鞣質(zhì)對(duì)小鼠體重的影響

分別于給藥前（即0 d）和給藥后第3天、第7天稱重，發(fā)現(xiàn)各組存活小鼠體重?zé)o顯著性差異，體重在給藥停止后逐漸增加。石榴皮鞣質(zhì)對(duì)小鼠體重的影響見(jiàn)表1。

表1 石榴皮鞣質(zhì)對(duì)小鼠體重的影響（±s，n＝10）Tab 1 Effect of P.granatum tannins on body weight of mice（±s，n＝10）

表1 石榴皮鞣質(zhì)對(duì)小鼠體重的影響（±s，n＝10）Tab 1 Effect of P.granatum tannins on body weight of mice（±s，n＝10）

組別A組B組C組D組E組F組G組劑量/mg·kg-1 4609.815670.076974.198578.2510551.1212978.2615963.00體重/g 0 d 20.59±2.2021.94±2.6020.86±1.5220.75±2.3121.36±1.8620.67±1.9020.46±1.233 d 24.54±1.7625.36±1.5523.12±1.2324.33±1.4324.54±1.7622.96±3.1021.87±2.057 d 26.60±2.0827.36±1.0925.65±2.1626.75±2.3126.24±1.4425.30±2.0323.66±1.94

3.2 石榴皮鞣質(zhì)對(duì)小鼠死亡率的影響和LD50計(jì)算

各組小鼠死亡多發(fā)生在給藥后1～3 d內(nèi)，小鼠死亡率呈劑量依賴性增高，具體表現(xiàn)為對(duì)刺激反應(yīng)減弱或消失，呼吸困難，心跳減弱直至死亡。對(duì)死亡小鼠立即解剖，可見(jiàn)肝臟出現(xiàn)白色點(diǎn)狀壞死，其它器官均正常。各組存活小鼠亦見(jiàn)類似癥狀，但較輕，當(dāng)日或次日即可進(jìn)食。小鼠ig給予石榴皮鞣質(zhì)的LD50＝8469.28 mg·kg-1；LD50的95%可信限＝（8469.28±1216.58）mg·kg-1（范圍：7252.70～9685.83 mg·kg-1）。石榴皮鞣質(zhì)對(duì)小鼠死亡率的影響見(jiàn)表2。

表2 石榴皮鞣質(zhì)對(duì)小鼠死亡率的影響（±s，n＝10）Tab 2 Effect of P.granatum tannins on mortality of mice（±s，n＝10）

表2 石榴皮鞣質(zhì)對(duì)小鼠死亡率的影響（±s，n＝10）Tab 2 Effect of P.granatum tannins on mortality of mice（±s，n＝10）

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3.3 石榴皮鞣質(zhì)對(duì)小鼠肝組織病理形態(tài)學(xué)的影響

病理切片顯示，隨劑量的增加，肝臟組織依次出現(xiàn)氣球樣改變、胞漿疏松化，點(diǎn)狀壞死以及大片狀壞死。石榴皮鞣質(zhì)對(duì)小鼠肝臟組織病理形態(tài)學(xué)的影響見(jiàn)圖1。

圖1 石榴皮鞣質(zhì)對(duì)小鼠肝組織病理形態(tài)學(xué)的影響A.A組；B.B組；C.C組；D.D組；E.E組；F.F組；G.G組Fig 1 Effect of P.granatum tannins on pathomorphology of liver tissue in miceA.A group；B.Bgroup；C.C group；D.D group；E.E.E mg·kg-1 group；F.F group；G.G group

4 討論

石榴皮性溫，味甘、酸、澀，具有澀腸、止血、收斂止瀉和殺蟲(chóng)功效。石榴皮主要成分為單寧，其含量約為10.4%～21.3%；其他成分包括蠟0.8%、樹(shù)脂4.5%、甘露醇1.8%、糖2.7%、樹(shù)膠3.2%、菊粉1.0%、黏質(zhì)0.6%、沒(méi)食子酸4.0%等[5]。但也有文獻(xiàn)[7]報(bào)道，單寧長(zhǎng)期大量應(yīng)用可引起肝小葉中央壞死、脂肪肝、肝硬化，過(guò)量服用可引起血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶異常增高和嚴(yán)重肝損壞，導(dǎo)致人體肝壞死[8]。單寧還能與皮下蛋白質(zhì)結(jié)合而產(chǎn)生沉淀，甚至能滲透過(guò)肝表皮細(xì)胞而產(chǎn)生沉淀，導(dǎo)致肝損壞[9]。

石榴皮所含的單寧主要是水解單寧，其毒性主要表現(xiàn)為直接肝臟毒性。本研究結(jié)果顯示，含單寧73%的石榴皮提取物在給藥劑量為15963.00 mg·kg-1時(shí)，其致死率為100%，根據(jù)改良寇氏法[5，6]求得石榴皮鞣質(zhì)的LD50＝8469.28mg·kg-1，LD50的 95%可信限＝（8469.28±1216.58）mg·kg-1（范圍：7252.70～9685.83 mg·kg-1）。出現(xiàn)死亡的小鼠表現(xiàn)為對(duì)刺激反應(yīng)減弱或消失，呼吸困難，心跳減弱，直至死亡，經(jīng)過(guò)尸檢發(fā)現(xiàn)有不同程度的肝臟壞死。肝臟病理學(xué)研究顯示，隨石榴皮鞣質(zhì)劑量的增加，肝臟組織出現(xiàn)劑量依賴性肝損傷和壞死，但其它器官良好，各組存活的小鼠體重?zé)o顯著性差異，體重在停藥后穩(wěn)步增長(zhǎng)。研究表明，石榴皮鞣質(zhì)應(yīng)避免大劑量一次性服用，以免造成肝損傷并導(dǎo)致死亡。石榴皮提取物長(zhǎng)期小劑量使用的安全性如何，尚需進(jìn)一步研究。

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