RP-HPLC法測定穿心蓮注射液中苯甲醇的含量Δ

葉靜，畢開順，宋肖煒，劉志紅，陳曉輝（沈陽藥科大學(xué)藥學(xué)院，沈陽市 110016）

穿心蓮注射液是由爵床科植物穿心蓮Andrographis paniculata（Burm.f.）Nees的干燥葉經(jīng)乙醇加熱回流提取制成的制劑，具有清熱、解毒、涼血、消腫等功效[1]。其在生產(chǎn)過程中加入一定量的苯甲醇為抑菌劑。但是，近年來苯甲醇的毒副作用屢有報(bào)道:2%苯甲醇在試管內(nèi)與兔和人的紅細(xì)胞接觸2 h即具有溶血作用，注射部位常發(fā)生青紫；它對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的毒性表現(xiàn)為頭暈頭痛、軟弱疲乏、視力模糊、惡心嘔吐、記憶力減退、步態(tài)不穩(wěn)和手足發(fā)麻等癥狀；對新生兒而言，苯甲醇及其氧化所得中間產(chǎn)物更易進(jìn)入腦內(nèi)，導(dǎo)致中毒甚至死亡。因此，國家食品藥品監(jiān)督管理局于2005年即發(fā)文要求在所有含有苯甲醇的注射液說明書中必須標(biāo)明“嚴(yán)禁兒童肌肉注射”的字樣[2]。除此之外，過量肌肉注射苯甲醇后，由于注射區(qū)常有硬結(jié)，還可引起臀肌攣縮并發(fā)癥，而臀大肌攣縮一經(jīng)出現(xiàn)，非手術(shù)治療是無效的。因此，苯甲醇含量測定是藥品質(zhì)控的重要內(nèi)容?！吨袊幍洹纺壳皩ψ⑸鋭┲幸志鷦┍郊状嫉挠昧可袩o明確規(guī)定，而穿心蓮注射液中苯甲醇的含量測定也未見有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。因此，為了降低不良反應(yīng)的發(fā)生幾率，有必要建立一種簡便、準(zhǔn)確的分析方法來控制穿心蓮注射液中苯甲醇的含量。

1 儀器與試藥

高效液相色譜（HPLC）儀，包括L-2130型液相色譜泵、L-2140型紫外檢測器（日本HITACHI公司）。

穿心蓮注射液（河南焦作市康華藥業(yè)有限公司，批號:09113001、09113005、09113006）；苯甲醇標(biāo)準(zhǔn)品（天津博迪化工股份有限公司，分析純，含量≥98.0%，批號:20100608）；乙腈（J&K SCIENTI FIC LTD.，色譜純）；水為娃哈哈純凈水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)品貯備液 取苯甲醇標(biāo)準(zhǔn)品適量，精密稱定，置于100 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，得濃度為11.9 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)品貯備液。

2.1.2 供試品溶液 取本品適量，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

2.1.3 陰性對照溶液 取穿心蓮葉，加20倍量90%乙醇熱浸提取3次，每次4 h，合并提取液，濾過，濾液回收乙醇至1∶1.5，加投料量5%～6%的活性炭加熱回流30 min，趁熱濾過，并用適量乙醇洗滌濾渣，合并濾液，加入3倍投料量的乙醇，攪拌均勻，靜置24 h，濾過，濾液回收乙醇，制成流浸膏。按處方量1/10取流浸膏1 g，加入乙醇，置水浴上加熱使溶解，再加入1.5 mL聚山梨酯80，攪勻，在攪拌下加入半量的注射用水，加入適量活性炭，充分?jǐn)噭颍蠓?0 min，冷卻至室溫，冷藏過夜，濾過，加注射用水至100 mL，用8%～10%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至6，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，即得缺苯甲醇的陰性對照溶液。

2.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱:Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相:乙腈-水（35∶65）；流速:0.5 mL·min-1；檢測波長:210 nm；柱溫:40℃；進(jìn)樣量:20 μL。在上述色譜條件下，苯甲醇理論板數(shù)不低于4000，分離度與拖尾因子均符合含量測定要求。色譜見圖1。

2.3 線性關(guān)系考察

精密量取苯甲醇標(biāo)準(zhǔn)品貯備液0.5、1、2、4、8、10 mL，分別置10 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，以0.45 μm微孔濾膜濾過，精密吸取續(xù)濾液20 μL注入液相色譜儀，按上述色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。以峰面積積分值（Y）對濃度（X，μg·mL-1）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y＝161560X+9028.1（r＝0.9999，n＝6）。結(jié)果表明，苯甲醇檢測濃度在0.595～11.900 μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。

2.4 檢測限與定量下限測定

取苯甲醇標(biāo)準(zhǔn)品貯備液（11.9 μg·mL-1）適量，逐級稀釋，按上述色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果，色譜峰信噪比（S/N）＝3時(shí)的檢測限為2.8 ng·mL-1，S/N＝10時(shí)的定量下限為5.6 ng·mL-1。

2.5 精密度試驗(yàn)

取同一標(biāo)準(zhǔn)品溶液適量，按上述色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。結(jié)果，苯甲醇峰面積的RSD＝0.3%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批（批號:09113001）穿心蓮注射液適量，共6份，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，按上述色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果，苯甲醇含量的平均值為3.13 μg·mL-1，RSD＝0.7%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一份供試品溶液適量，室溫下放置，分別于0、1、2、4、8 h進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果，苯甲醇峰面積的RSD＝1.4%（n＝5），表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的穿心蓮注射液（批號:09113001，苯甲醇含量:3.13 μg·mL-1）5 mL，共9份，置10 mL 量瓶中，3份為一組，分別精密加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)品貯備液（11.9 μg·mL-1），以水稀釋定容，制成低、中、高3種濃度的供試品溶液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，按上述色譜條件進(jìn)樣測定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。

2.9 樣品含量測定

分別取不同批號穿心蓮注射液適量，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)樣分析，采用外標(biāo)法以峰面積計(jì)算苯甲醇的含量，結(jié)果見表2。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab 1 Results of recovery test（n＝9）

表2 穿心蓮注射液中苯甲醇的含量測定結(jié)果（n＝5）Tab 2 Content determination of benzyl alcohol in Chuanxinlian injection（n＝5）

3 討論

苯甲醇是注射劑中最常用的抑菌劑，連續(xù)肌肉注射可使局部產(chǎn)生硬結(jié)而影響藥物的吸收。新生兒應(yīng)用本品稀釋和配制藥物可引起中毒死亡，死亡原因是代射性酸中毒中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制、低血壓、血小板減少、肝腎衰竭和顱內(nèi)出血等。美國FDA建議新生兒不應(yīng)使用含苯甲醇的藥物。此外，國外還有鞘內(nèi)注射含苯甲醇注射液后引起無菌性腦膜炎的報(bào)道[3]。

苯甲醇在注射劑中的加入量一般為1%～2%[4]，因不同廠家生產(chǎn)工藝不同，注射劑中苯甲醇含量相差較大[5]，但迄今為止《中國藥典》對其含量限度尚無明確規(guī)定。從本試驗(yàn)樣品檢測結(jié)果來看，該廠家生產(chǎn)的不同批號的穿心蓮注射液中苯甲醇含量僅為微克級。

綜上，本試驗(yàn)所建立的反相高效液相色譜法簡便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于穿心蓮注射液的質(zhì)量控制。

[1]鄭虎占，董澤宏，佘 靖.中藥現(xiàn)代研究與應(yīng)用[M].北京:學(xué)苑出版社，1998:349.

[2]陳 詠，林 紅.HPLC法測定魚肝油酸鈉注射液中苯甲醇的含量[J].海峽藥學(xué)，2009，21（11）:71.

[3]陳朝鳳.藥物制劑中附加劑的不良反應(yīng)[J].科技資訊，2005，3（24）:174.

[4]謝秀瓊.中藥新制劑開發(fā)與應(yīng)用[M].第3版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2006:146.

[5]葛海生，劉元瑞，趙康虎.HPLC法測定克林霉素磷酸酯注射液中抑菌劑苯甲醇的含量[J].中國藥房，2010，21（25）:2376.