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    槐杞黃對哮喘大鼠BALF中IL-5及INF-γ的影響

    2011-05-21 07:47:06張琴珍尚云曉
    實(shí)用藥物與臨床 2011年1期
    關(guān)鍵詞:槐杞細(xì)胞因子試劑盒

    張琴珍,尚云曉

    支氣管哮喘是以氣道高反應(yīng)性和嗜酸性粒細(xì)胞性氣道炎癥為特征的免疫紊亂性疾病。眾多研究表明,Th1/Th2功能失衡、Th2細(xì)胞優(yōu)勢分化是導(dǎo)致哮喘發(fā)病的重要機(jī)制之一[1]。IL-5是由Th2細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子,它促進(jìn)嗜酸性粒細(xì)胞的產(chǎn)生和在氣道的聚集。Th1細(xì)胞分泌INF-γ等細(xì)胞因子,抑制哮喘反應(yīng)。目前,支氣管哮喘的治療主要依靠抗炎和解痙,而針對免疫發(fā)病機(jī)制的治療較為薄弱。槐杞黃為臨床輔助治療兒童支氣管哮喘的免疫調(diào)節(jié)藥物,本實(shí)驗(yàn)通過給予哮喘動物模型不同的干預(yù)措施,測定Th1、Th2細(xì)胞因子水平,比較不同干預(yù)效果,以期為兒童哮喘的臨床治療提供理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 主要試劑和儀器 卵蛋白(美國Sigma公司),百日咳滅活菌苗(北京生物制品研究所),醋酸地塞米松片(天津藥業(yè)有限公司),槐杞黃(啟東蓋天力藥業(yè)有限公司),ELISA試劑盒(美國GBD公司)。

    1.2 實(shí)驗(yàn)動物 雌性Wistar大鼠40只,SPF級,體質(zhì)量(140±10)g,由中國醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室動物部提供,飼養(yǎng)條件一致。

    1.3 分組和模型制備

    1.3.1 動物分組 隨機(jī)分成4組:正常對照組(N)、哮喘模型組(A)、地塞米松組(DXM)、地塞米松組+槐杞黃組(H),每組10只。按不同的影響因素分別進(jìn)行研究。飼養(yǎng)期間給予正常飲食。

    1.3.2 大鼠哮喘模型的制作[2]除N組外,于第1、7天,各組大鼠腹腔注射1%卵蛋白1 mg、1%氫氧化鋁凝膠及6×109/mL百日咳滅活菌苗致敏液共1 mL,共致敏2次。第15天開始霧化吸入2%卵蛋白誘喘。每日30 min,連續(xù)7 d。N組大鼠以生理鹽水代替激發(fā)液進(jìn)行處理。

    1.3.3 給藥 自第15天起連續(xù)7 d,激發(fā)前30 min,各組灌胃給藥(均配成3 mL)。N組:生理鹽水3 mL;A組:生理鹽水3 mL;D組:地塞米松1 mg/kg,3 mL;H組:地塞米松1 mg/kg+槐杞黃8 g/kg,3 mL。

    1.4 取材 于末次激發(fā)后24 h內(nèi)取材。以10%水合氯醛0.4 mL/100 g麻醉后,固定于解剖板,75%酒精消毒,打開胸腔和頸部。心尖取血,靜置2 h,3 000 r/min 4℃離心10 min,取上清 -80℃保存待測細(xì)胞因子。支氣管肺泡灌洗液(BALF)中嗜酸性粒細(xì)胞(Eos)計數(shù):①止血鉗夾閉氣管上端和右肺主支氣管;②灌洗支氣管和左側(cè)肺:用密閉式靜脈留置針插入氣管上端,0.5 mL PBS反復(fù)沖洗,共4次,共回收到1.7 mL以上灌洗液,回收率超過85%;③灌洗液4℃、1 500 r/min離心10 min;④回收上清,-80℃保存待檢細(xì)胞因子;⑤用1 mL含有1%BSA的PBS重懸細(xì)胞沉淀,取10 μL重懸液進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。余液再次4℃離心,參數(shù)同上;⑥離心后去上清,滴入1滴血清,輕吹散細(xì)胞,涂片3張;⑦涂片瑞氏-吉姆薩染色,細(xì)胞分類計數(shù),于光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞分類,至少數(shù)300個細(xì)胞每視野,至少進(jìn)行4個視野的細(xì)胞計數(shù)。算出嗜酸細(xì)胞的百分比,用細(xì)胞總數(shù)乘以百分比,即得出嗜酸細(xì)胞的絕對值。

    1.5 ELISA檢測各組大鼠血清OVA特異性IgE、BALF中 IL-5、INF-γ 嚴(yán)格按照試劑盒(美國GBD公司)要求操作,試劑盒的檢測最低限為1 ng/mL。IL-5、INF-γ操作步驟按試劑盒要求進(jìn)行。擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到直線方程后,根據(jù)各樣品孔OD值推算出樣品中IL-5、INF-γ含量(pg/mL)。

    1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件行統(tǒng)計分析。計量資料以±s表示,組間比較采用單因素方差分析,ANOVE Tukey檢驗(yàn)比較各組間差異。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 一般情況觀察 經(jīng)OVA激發(fā)后,模型組小鼠出現(xiàn)煩躁不安、呼吸增快、咳嗽、腹肌收縮、弓背向上、抓撓口鼻、反應(yīng)遲鈍、二便失禁等癥狀,嚴(yán)重者可見呼吸急促,呼吸節(jié)律不整,口唇紫紺;長期激發(fā)可見體質(zhì)量減輕,毛色失去光澤,精神狀態(tài)差。給藥組和陽性對照組上述癥狀可獲得不同程度的緩解。

    2.2 對血清各項指標(biāo)的影響 對血清中OVAIgE、BALF中IL-5含量和細(xì)胞總數(shù)(×106/mL)及Eos%的影響:上述各指標(biāo)A組較N組顯著增高(P<0.05);D組和H組較哮喘模型組有所改善(P<0.05);H組較D組進(jìn)一步下降(P<0.05);與N組相比,H組OVA-IgE、IL-5含量和Eos%基本降至正常水平,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。BALF中 INF-γ的水平:A組低于 N組(P<0.05);D組和H組各指標(biāo)較A組回升(P<0.05);H組較D組進(jìn)一步回升(P<0.05),與N組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

    表1 不同干預(yù)對血清各項指標(biāo)的影響(±s)

    表1 不同干預(yù)對血清各項指標(biāo)的影響(±s)

    注:與正常組比較,*P<0.05;與哮喘組比較,#P<0.05

    組別 只 OVA-IgE IL-5 INF-γ 細(xì)胞總數(shù) Eos(%)P N 10 172.29±2.98 22.87±6.26 80.19±8.82 1.17±0.34 0.89±0.49 <0.05#10 436.40±2.77 54.94±10.32 55.83±10.08 2.91±0.62 20.85±17.49 <0.05*D 10 268.56±4.83 43.63±7.96 63.10±5.75 2.07±0.63 11.55±7.73 <0.05*#H 10 179.22±3.98 27.61±5.24 74.43±7.60 1.52±0.53 2.52±4.40 <0.05#*A

    3 討論

    大量研究表明,支氣管哮喘的發(fā)病過程中存在Th2細(xì)胞的過度分化和Th2細(xì)胞因子的過度分泌,是氣道炎癥啟動和維持的關(guān)鍵因素。在哮喘的發(fā)病機(jī)制中,細(xì)胞因子不僅在慢性氣道炎癥中起著重要作用,在很大程度上還決定著Th細(xì)胞的分化趨勢。有研究表明,Th類型的主要依據(jù)為Th0在受到外界抗原刺激后,主要分泌哪類細(xì)胞因子,而調(diào)控和決定細(xì)胞因子產(chǎn)生的關(guān)鍵取決于哪類轉(zhuǎn)錄因子占主導(dǎo),STAT4/STAT6、T-bet/GATA-3兩組轉(zhuǎn)錄因子在Th0分化中起關(guān)鍵作用[3]。IL-5的異常分泌與轉(zhuǎn)錄因子 Sp1、E12/E47、Oct-2、c/EBPbeta、GATA-3和酪氨酸激酶JAK2、JAK1等表達(dá)異常有關(guān)[4-5]。Th2細(xì)胞主要分泌包括 IL-5在內(nèi)的一系列細(xì)胞因子。IL-5是Eos的存活發(fā)育因子,可刺激骨髓Eos增生,并促使Eos從骨髓到外周血再向氣道募集,是較強(qiáng)的Eos增殖和趨化因子。IL-5還可促使Eos活化,并誘導(dǎo)Eos釋放陽離子蛋白等毒性蛋白顆粒,產(chǎn)生過氧化物陰離子等增多。另外,IL-5還可以通過抑制Eos凋亡而增強(qiáng)其存活力,從而導(dǎo)致哮喘的嗜酸性粒細(xì)胞性氣道炎癥[6]。Th1細(xì)胞主要分泌包括INF-γ在內(nèi)的一系列細(xì)胞因子。INF-γ在支氣管哮喘中起保護(hù)作用,其分泌減少與哮喘的發(fā)生關(guān)系密切[7]。眾多研究表明,糾正Th1/Th2功能失衡,可以減輕支氣管哮喘的癥狀[8]?;辫近S由中藥槐耳、枸杞和黃精等成分組成。體外研究表明,中藥槐耳可通過多種途徑對T淋巴細(xì)胞紊亂進(jìn)行調(diào)節(jié)[9]。筆者通過比較干預(yù)前后各種細(xì)胞因子水平,證實(shí)哮喘大鼠模型存在嗜酸性粒細(xì)胞大量聚集的氣道炎癥、Th2優(yōu)勢分化和Th2細(xì)胞因子過度分泌的Th1/Th2功能失衡。通過地塞米松的治療,上述情況可以得到一定程度的緩解,而加用槐杞黃則可使上述情況基本恢復(fù)至正常水平。本實(shí)驗(yàn)僅初步驗(yàn)證了槐杞黃可調(diào)節(jié)Th1/Th2功能失衡,其具體機(jī)制尚待進(jìn)一步的研究。

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