牛布魯氏菌OM P25的原核表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物的免疫學(xué)特性

劉艷琴，海 巖 ，吳樹清

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古疾病預(yù)防控制中心，呼和浩特 010031）

布魯氏菌（Brucella）是革蘭氏陰性兼性細(xì)胞內(nèi)寄生菌，能引起多種家畜的流產(chǎn)、不育，引起人的以發(fā)熱和不育為特征的布魯氏菌病，給畜牧業(yè)發(fā)展和人的健康造成極大的危害。最早于1887年，Bruce從死于“馬爾他熱”的英國士兵脾臟中分離出來[1]，目前世界各國布魯氏菌病普查及貿(mào)易檢疫最常用的方法是檢測抗菌體表面脂多糖（LPS）抗體的血清學(xué)方法，由于LPS與其他種屬革蘭氏陰性細(xì)菌之間結(jié)構(gòu)上存在一定的相似性，常導(dǎo)致檢測試驗結(jié)果假陽性出現(xiàn)。很多學(xué)者研究表明，布魯氏菌菌體蛋白抗原誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的免疫學(xué)反應(yīng)則具有很高的特異性。

布魯氏菌主要外膜蛋白（OMPs）被證明具有抗原性和免疫保護(hù)作用，根據(jù)分子量可將外膜蛋白分為三組，其中第一組外膜蛋白分子量在36-38kDa之間，主要包括OMP10和OMP19；第二組為膜孔蛋白分子量在31-34kDa之間，編碼第二組外膜蛋白的基因有兩個OMP2a和OMP2b；第三組外膜蛋白分子量在25-27 kDa之間[2]，編碼第三組主要外膜蛋白的兩個基因分別命名為OMP25和OMP31。其中，OMP25基因在布魯氏菌的所有菌種中是高度保守的，同源性達(dá)98%以上，由核酸變化所引起的氨基酸變化不超過5個，OMP25的缺失可以使布魯氏菌毒力減弱，并能夠?qū)λ拗髌鸬矫庖弑Ｗo(hù)作用[3]。因此，本研究對OMP25基因進(jìn)行克隆和表達(dá)及抗原特異性檢測，為研制中和保護(hù)抗體與診斷試劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株、載體及主要試劑

布魯氏菌參考菌株A544購自中國獸藥監(jiān)察所；菌株3313為內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物實驗室分離株；質(zhì)粒pGEX-6p-1及大腸桿菌BL21為東北農(nóng)業(yè)大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)微生物實驗室保存；牛布魯氏菌陽性血清和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清由本實驗室保存；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記兔抗牛IgG購自sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 目的片段的擴(kuò)增及克隆測序

根據(jù)GenBank中OMP25基因核苷酸序列及表達(dá)載體的特異性，利用生物軟件Primer5.0設(shè)計了1對特異性引物:上游引物P1:5'-GCGAATTCATG CGCACTCTTAAGTC-3'；下游引物 P2:5'-GCCTCGA GAGAACTTGTAGCCGATG-3'。并分別在上下游引物的5'端加入EcoR I和Xho I酶切位點。PCR反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性5min；94℃變性 30 s，55℃復(fù)性50 s，72℃延伸1min，進(jìn)行35個循環(huán)；最后72℃延伸10min。同時設(shè)去離子水對照。PCR反應(yīng)結(jié)束后用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測并觀察結(jié)果（圖1）。

對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后切膠回收，按北京百泰克生物技術(shù)有限公司的多功能DNA純化回收試劑盒說明進(jìn)行回收操作，回收產(chǎn)物與pMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)入宿主菌JM109，挑取陽性重組菌進(jìn)行培養(yǎng)，堿變性法提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR和EcoRI與XhoI雙酶切鑒定。委托大連寶生物公司測序，并與GenBank中報道的OMP25基因序列進(jìn)行同源性比較。

1.2.2 表達(dá)載體構(gòu)建

用AxyprepTM DNA Gel Extraction Kit純化經(jīng)限制性內(nèi)切酶 EcoRI、XhoI雙酶切后的 pMD19-T OMP25和pGEX-6p-1，膠回收產(chǎn)物在T4 DNA連接酶作用下，16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化至JM109，涂LB平板（Amp抗性），37℃培養(yǎng)過夜，挑取單克隆菌落37℃過夜搖菌培養(yǎng)，堿變性法提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR和EcoRI與XhoI雙酶切鑒定。陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至JM109，涂LB平板（Amp抗性），37℃培養(yǎng)過夜，挑取單克隆菌落37℃過夜搖菌，堿裂解法提取質(zhì)粒，再次進(jìn)行PCR和EcoRI與XhoI雙酶切鑒定。將鑒定為陽性的克隆株送至南京金斯特生物工程有限公司測序，進(jìn)一步鑒別出正向插入pGEX-6p-1基因和讀碼框正確的重組子，并將其命名pGEX-OMP25將陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞，在含50 μ g/mL Amp的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)。

1.2.3 pGEX-OMP25重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定

將鑒定為陽性重組菌液30μL接種于3mL含有50 μ g/mL Amp的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。取過夜培養(yǎng)物按1%的量接種在的LB培養(yǎng)基中至OD600值約為 0.6～1.0 h，加入 IPTG誘導(dǎo)，并用SDS-PAGE檢測表達(dá)產(chǎn)物，同時用未誘導(dǎo)的菌液和空載體作為陰性對照（圖3）。

將上述的誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物以12000 r/min離心收集菌體提取包涵體，置冰浴中超聲波處理10min后11000 r/min轉(zhuǎn)4℃離心10min，分別收集上清和沉淀。將上清和沉淀懸浮液分別進(jìn)行SDS-PAGE和Western-blotting分析，檢測表達(dá)產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量和反應(yīng)原性（圖4）。

1.2.4 表達(dá)產(chǎn)物的純化及免疫學(xué)特性檢測

用SDS-PAGE和Western-blotting方法檢測表達(dá)產(chǎn)物包涵體量和免疫反應(yīng)活性。然后切膠用電洗脫方法進(jìn)行蛋白純化。對純化產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE分析（圖 5）。

將純化的蛋白與弗氏完全佐劑乳化后免疫家兔，制備抗血清，用ELISA方法檢測抗體效價。將布魯氏菌S2疫苗株及其它對照菌株同時滅活，超聲波破碎菌體包被96孔酶標(biāo)板，同時用TBS包被酶標(biāo)板作對照，4℃過夜；棄去液體，洗3次拍干；10g/LBSA封閉，37℃孵育2h；棄去液體，洗3次拍干；加入適當(dāng)稀釋的陰性、陽性血清及實驗動物血清，于37℃孵育2h；棄去液體，洗3次拍干；加入稀釋至工作濃度（1:5000稀釋）的山羊抗兔酶標(biāo)抗體100μL，37℃孵育1h；棄去液體，洗3次拍干；加入顯色液，37℃孵育10～15min；加入終止液；測OD492值。以陽性血清孔的OD492值接近1.0，P/N>2.0時說明所制血清與S2抗原有一定的特異性。

2 結(jié)果

2.1 目的基因的PCR擴(kuò)增

用設(shè)計的引物擴(kuò)增得到目的條帶，經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳分析，擴(kuò)增出了大約642 bp的條帶（圖1），與預(yù)期結(jié)果一致。

2.2 pGEX-OMP25重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定

pGEX-OMP25重組質(zhì)粒經(jīng)EcoRI與XhoI雙酶切鑒定，結(jié)果（圖2）表明，pMD19-T-OMP25蛋白基因已插入載體中，與預(yù)期的結(jié)果相符，獲得了含有OMP25基因的重組表達(dá)片段的陽性克隆。測序發(fā)現(xiàn)pMD19-OMP25蛋白基因正向插入pGEX-6p-1載體。將重組質(zhì)粒命名為pGEX-OMP25。

2.3 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析

對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE分析表明，pGEXOMP25表達(dá)出了49 kD的條帶（圖3），與預(yù)期結(jié)果一致，說明重組蛋白已成功表達(dá)。誘導(dǎo)表達(dá)4 h的表達(dá)量與5、6、7 h的表達(dá)量差不多,所以取4 h為誘導(dǎo)時間。

2.4 表達(dá)產(chǎn)物的Western-blotting

Western-blotting分析結(jié)果表明，表達(dá)的目的蛋白能與流產(chǎn)布魯氏菌陽性血清發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)，49 kD處出現(xiàn)特異免疫反應(yīng)條帶（圖4）。

2.5 表達(dá)產(chǎn)物純化結(jié)果

按照電洗脫的操作說明書，對切膠回收的目的蛋白進(jìn)行洗脫，產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳分析表明獲得了高純度的目的蛋白（圖5）。

2.6 表達(dá)產(chǎn)物的特異性檢測

將鼠沙門氏菌，波氏桿菌，沙雷氏菌，巴氏桿菌，李氏桿菌做同樣的超聲波處理，做ELISA包被，4℃包被過夜。結(jié)果所制血清與S2的P/N比達(dá)到2以上，有一定的特異性（表1）。

表1 特異性實驗結(jié)果

3 討論

布魯氏菌的抗原組成復(fù)雜，其外膜蛋白在1980的早期被發(fā)現(xiàn)是具有免疫原性和保護(hù)性的抗原[4]，OMP25基因在布魯氏菌種，生物變型和菌株中高度保守[5]。國外的研究工作已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并篩選了部分具有較好免疫原性的蛋白質(zhì)作為布魯氏菌診斷和亞單位疫苗的候選蛋白。其中由于布魯氏菌的外膜蛋白（OMPs）是暴露于S菌的表面上，不僅能與IgG 抗體發(fā)生反應(yīng)，而且可以引起保護(hù)性免疫反應(yīng)，一直被作為研究的重點[5]。

本實驗克隆并表達(dá)了布魯氏菌外膜蛋白OMP25，構(gòu)建了含有布魯氏菌外膜蛋白OMP25的原核表達(dá)載體PGEX-OMP25，并經(jīng)過雙酶切、PCR鑒定，均證明目的基因確實插入了表達(dá)載體。利用DNAStar等生物軟件分析測序結(jié)果，結(jié)果顯示插入片斷與布魯氏菌OMP25基因序列完全一致。說明布魯氏菌OMP25基因的原核表達(dá)載體構(gòu)建成功，利用IPTG（其終濃度達(dá)到0.5mmol/L，37℃誘導(dǎo)4 h）誘導(dǎo)，在其宿主菌大腸桿菌BL21中以融合蛋白的形式表達(dá)。PGEX-6P-1的GST標(biāo)簽與外源蛋白的融合表達(dá)，有助于提高表達(dá)蛋白的穩(wěn)定性。同時目標(biāo)蛋白的分子量相對較小，在抗原抗體反應(yīng)中效果不太好；以融合蛋白的形式表達(dá)，增加了目標(biāo)蛋白的分子量，這為今后研究表達(dá)蛋白的免疫學(xué)特性的研究提供了方便。用表達(dá)的蛋白電洗脫純化與弗氏完全佐劑乳化后免疫家兔制備抗血清，通過 ELISA和Western-blot方法特異性檢測發(fā)現(xiàn)，所制的抗血清可以與布魯氏菌S2疫苗株的菌體抗原發(fā)生特異性反應(yīng)，而與臨床中易于布魯氏菌發(fā)生交叉反應(yīng)的革蘭氏菌的P/N比相對有明顯的區(qū)別。因此，此研究為病原學(xué)的檢測提供了一個新途徑，同時為進(jìn)一步檢測布魯氏菌病奠定了基礎(chǔ)。

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[4]EdmondsM D， CloeckaertA， HagiusS D，etal.Pathogenicity and protective activity in pregnant goats of a Brucella melitensis Delta OMP25 deletion mutant[J].Res Vet Sci，2002，72（3）:235-239.

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