門源縣泉灣養(yǎng)雞場新城疫抗體水平監(jiān)測

童海龍

（青海省門源縣青石嘴獸醫(yī)站，青海 門源 810301）

本次檢測對門源縣某雞場已經(jīng)過新城疫免疫的雞群進行新城疫抗體水平監(jiān)測。該雞場有零星散發(fā)的雞只死亡的情況出現(xiàn)，通過病理表現(xiàn)及（HA）實驗檢疫，所發(fā)病雞為新城疫感染，考慮到該場已作過新城疫免疫接種，采用（HI）實驗詳細了解該場新城疫抗體水平，并作出相應處理措施以進一步深入防止新城疫病毒的入侵。

1 材料

1.1 試驗儀器

注射器、玻棒、96孔微量板、微量加樣槍、恒溫水浴箱、冰箱、針頭、試管、微型震蕩器、離心機。

1.2 試驗試劑

生理鹽水、枸櫞酸鈉抗凝劑、任氏液、1%的雞紅細胞。

1.3 診斷抗原

新城疫病毒。

2 方法

2.1 血液樣品的處理

在養(yǎng)雞場隨機采血樣60份，對其進行編號，保存于10℃左右，在3天之內(nèi)，將血樣以3000 r/min離心10min，將上層的血清吸入干凈的離心管中，置于4℃下保存。

2.2 枸櫞酸鈉抗凝劑的制備

先稱取檸檬酸鈉3.8 g粉末，加入100mL蒸餾水定容，裝瓶，121℃高壓滅菌15min，得到的抗凝劑濃度為3.8%。

2.3 單位抗原的配制

先從冰箱中取出保存的凍干的濃縮抗原，將其放在室溫條件下待完全溶化。與2mL蒸餾水稀釋溶化后，通過血凝試驗測其抗原效價，以能引起100%血凝的病毒最高稀釋度作為抗原的效價，此稀釋度為1個HA單位抗原。例如血凝終點滴度為1:512，則4個單位的稀釋度為1:128，將1mL抗原加入127mL生理鹽水，即為4單位抗原[3]。

2.4 配制1%的紅細胞懸浮液

隨機選取3只成年公雞，從頸靜脈采血，總共采100mL，并將其迅速加入含有枸櫞酸鈉抗凝劑的空容量瓶中，輕輕振蕩使血液與枸櫞酸鈉充分混勻。取10mL血液和90mL生理鹽水共同加入一個大離心管中進行3000 r/min的離心處理5分鐘，離心完之后將其上清液倒去，以上操作重復3至4次。操作完畢之后，用10μL量程的微量加樣槍吸取5μL的紅細胞加入495μL的生理鹽水中，充分混勻，就制成了1%的紅細胞懸浮液。

2.5 血凝和血凝抑制試驗方法（HA是測抗原水平，HI測被檢樣品的抗體水平）

采用血凝（HA）和血凝抑制（HI）試驗，利用血凝素（HA）蛋白的抗體與受體的特異性結(jié)合能夠干擾HA蛋白與紅細胞受體的結(jié)合從而出現(xiàn)抑制現(xiàn)象，用來檢測禽血清中的免疫抗體，在進行HI試驗之前必須進行HA試驗，以確定HI試驗中所用抗原HA滴度[2]。

結(jié)果判定標準 以100%抑制凝集的血清最大稀釋孔以該血清的滴度，即血清效價（HI）。免疫后的HI效價≥5log2為陽性，判定為免疫合格；HI效價<5log2為陰性，判定為不合格。免疫合格率在70%以上則可判定為免疫合格場。

2.5.1 血凝試驗（HA）

在V型微量反應板上每孔加入0.050mL生理鹽水，在第一孔中加入0.050mL病毒懸液，為準備測定一個HA單位，在測試前作一系列的稀釋，將病毒以0.050mL的體積做倍比稀釋。每孔再加入0.050mmL生理鹽水，每孔加入0.050mL1%的雞紅細胞。輕輕混勻，在室溫條件下（20℃）靜置40min，對照住紅細胞應該明顯呈紐扣狀。判定血凝滴度:將板傾斜，觀察紅細胞有無蹭淚珠狀流淌，完全血凝的最高稀釋倍數(shù)代表一個血凝單位。

2.5.2 血凝抑制試驗（HI）

微量反應板每孔加入0.050mL生理鹽水。第1孔加入0.010mL樣品血清。將血清做0.010mL體積作倍比稀釋。倍比稀釋至最后1孔，吸出0.010mL液體棄去。棄去之后，每孔加入含有4個單位的病毒抗原0.050mL，再每孔加入0.050mL的1%的雞紅細胞（在加入過程中應充分混勻，不間斷的輕微振蕩，防止血細胞凝結(jié)），混勻后放入水浴箱中靜置30mL，對照組紅細胞應該呈現(xiàn)顯著地紐扣狀，能完全抑制4個單位抗原的血清最高稀釋度作為HI滴度。將板傾斜觀察，可更確切的判定結(jié)果。只有那些紅細胞同對照組孔幾乎以同樣比列淚流樣的方可判定為抑制陽性。只有陰性對照血清滴度不大于1/4，陽性對照組血清誤差不超過一個滴度，試驗結(jié)果才有效。

3 結(jié)果

3.1 新城疫的抗體效價

表1 新城疫抗體效價分布情況

3.2 免疫合格率的判定

由表1可知新城疫抗體效價≥5log2為67%，這部分雞免疫合格；抗體效價≥6log2和≥7log2的分別達到63%和56%，這部分的雞獲得了較高的保護性；但是抗體水平≥5log2百分率低于70%，說明此疫苗獲得的免疫效果不是很好，沒有達到預期的效果，不能有效的抵抗新城疫病毒，所以有新城疫病雞零星的出現(xiàn)。

4 根據(jù)試驗結(jié)果對該雞場新城疫防治的建議

4.1 由試驗結(jié)果可知新城疫抗體效價≥5log2的僅為67.65%，未達到規(guī)定的70%，說明結(jié)果免疫后，并沒有達到預期效果，在免疫上存在缺陷，需要進行補免，否則一旦新城疫病毒入侵就有可能引發(fā)新城疫。

4.2 防制ND是一項十分艱巨和復雜的任務要采取嚴格的生物安全措施，防止NDV強毒進入。如日常的隔離、衛(wèi)生、消毒制度[3]；防止一切帶毒動物（特別是鳥類、鼠類和昆蟲）和污染物進入禽群；進出的人員和車輛及用具消毒處理；飼料和飲水來源安全；不從疫區(qū)引進種蛋和苗雞，新購進的雞隔離觀察2周以上證明健康者，方可合群；科學的畜牧制度，如全進全出等；禽場的選址、生產(chǎn)的規(guī)模等均有利于防止病原體進入[4]。

必須指出，很多禽場對以上措施認識不足，而過分依賴疫苗接種。今年來的研究表明，只要NDV強毒侵入禽群，就能長期傳播維持，不論采用何種免疫措施都不能將其從群內(nèi)清楚。在這個意義上，防止NDV強毒進入禽群是頭等重要的防制措施[4]。

4.3 接種疫苗可以提高禽群的特異免疫力，減少NDV強毒的傳播，降低ND造成的損失。ND免疫計劃中疫苗的選擇和合理免疫程序的制定受母體抗原高低、強毒感染危險大小、畜牧制度和其他感染存在多種因素影響，必須根據(jù)具體雞群而確立，不能一概而論。ND傳播迅速，死亡率很高，是嚴重危害養(yǎng)禽業(yè)的重要疾病之一，可造成巨大的經(jīng)濟損失。所以我們要做好雞群的抗體水平監(jiān)測工作，制訂科學的免疫程序，科學確定首免、二免、三免日齡。

5 結(jié)論

通過本次試驗的結(jié)果表明該雞場為免疫不合格場，免疫合格率低于70%，必須經(jīng)過補免或再次免疫，以提高該雞場的免疫力，才能有效的防止新城疫病毒的入侵。該雞場在免疫上存在很多問題，需要及時改正，嚴格按照科學的免疫程序，做好雞群的抗體水平監(jiān)測。

[1]鄭明球.家畜傳染病學實驗指導[M].3版.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，2001，107-111.

[2]黃文忠.雞新城疫血凝抑制試驗（HI）的影響因素[J].中國家禽，2000，22（5）:29.

[3]鄭世軍.雞病免疫防制技術[M].北京:北京農(nóng)業(yè)大學出版社，1994，47-51.

[4]徐宜為.最新禽病與防制[M].北京:中國農(nóng)業(yè)科技出版社，1993，44-45.