丁酸氫化可的松中有關(guān)物質(zhì)檢測方法的改進(jìn)

張新勇，霍立茹

南京長澳醫(yī)藥科技有限公司，南京 210038

《中國藥典》2005版中收錄的關(guān)于丁酸氫化可的松有關(guān)物質(zhì)的高效液相色譜法采用水-乙腈-冰醋酸（55︰45︰0.5）為流動相，檢測波長為240 nm，理論塔板數(shù)不低于1500。我們通過對丁酸氫化可的松原料藥的紫外光譜分析以及流動相和色譜柱的對比，對藥典中關(guān)于該藥的有關(guān)物質(zhì)檢測進(jìn)行改進(jìn)性研究，結(jié)果表明采用Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm 色譜柱，0.02 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液（用磷酸調(diào)節(jié)pH 值至3.5）-甲醇-四氫呋喃（20︰65︰15）為流動相，紫外檢測波長為314 nm，不僅檢出信息量大，而且雜質(zhì)檢出多，分離效果好，理論塔板數(shù)不低于2000，優(yōu)于藥典的規(guī)定。

1 儀器與藥品

Yanaco微量熔點測定儀；紫外光譜分析儀；島津UV-2550PC紫外可見分光光度計；高效液相色譜儀，Agilent 1100 HPLC Series及 H66MC型超聲儀。

丁酸氫化可的松原料與對照品（自制）。

甲醇、乙腈為色譜純；磷酸、磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉、四丁基溴化銨、辛烷磺酸鈉、乙酸銨、四氫呋喃、醋酸鈉和磷酸二氫銨為分析純。

2 方 法

2.1 熔點的測定

取本品，研成細(xì)粉,依據(jù)《中國藥典》2010年版二部ⅥC規(guī)定，測定其熔點。以195℃作為起始溫度，以1.0℃·min-1的速率升溫。最終得出20090401批樣品的熔點為206.0～207.5℃，小于藥典熔距(4℃)要求。

2.2 紫外吸收光譜

取本品，加乙醇制成每1 mL中約含8 μg的溶液，照分光光度法 （《中國藥典》2010年版二部IV A）測定，結(jié)果見圖1。本品在314 nm的波長處有最大吸收，在330 nm處有次大吸收，在260 nm的波長處有最小吸收。

圖1 丁酸氫化可的松紫外掃描圖

2.3 有關(guān)物質(zhì)的檢測

2.3.1 色譜條件的篩選色譜柱的選擇 選擇不同廠家、不同牌號色譜柱進(jìn)行試驗，以能有效地檢出雜質(zhì)，分離效果好，主成分保留時間適中的色譜柱，供檢測本品有關(guān)物質(zhì)使用。Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱分離效果好，主成分保留時間適中，比Kromasil色譜柱檢出雜質(zhì)多、檢出主峰前的一個雜質(zhì)。故選擇此色譜柱。

2.3.2 流動相的選擇本品根據(jù) 《中國藥典》2010版，選擇不同的流動相體系，并對流動相組成的比例以及鹽溶液pH值進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。以分離效果較好，能有效地檢出雜質(zhì)，主成分保留時間適中的流動相作為本品的流動相。再從起始原料及中間體分離效果，峰形，主成分保留時間，可重復(fù)性，以及對色譜柱的保護(hù)等因素綜合考慮，在幾組流動相中，經(jīng)比較最終選用0.02 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液（用磷酸調(diào)節(jié)pH 值至3.5）-甲醇-四氫呋喃（20:65:15）為流動相。

2.3.3 測定波長選擇取本品適量，加流動相制成1 mg·mL-1的溶液，用高效液相色譜儀進(jìn)行全波長掃描（190～400 nm）。將液相色譜儀二極管陣列檢測器的波長，分別設(shè)定在330 nm和260 nm進(jìn)行試驗，并將結(jié)果進(jìn)行對比分析，最終選擇信息量比較大，能有效檢出雜質(zhì)的314 nm，作為本品的測定波長。

2.3.4 供試品濃度的確定取本品適量，加流動相分別制成每1mL中含0.0512、0.1024、0.2048mg的溶液，作為供試品溶液。進(jìn)樣量為20μL，記錄色譜圖。

試驗結(jié)果顯示，0.1024、0.2048 mg·mL-1的供試品溶液能有效地檢出雜質(zhì)?？紤]到對色譜柱壽命的影響，故選定約0.1 mg·mL-1的溶液，作為供試品溶液的濃度。

2.3.5 色譜柱的理論板數(shù)及分離度在選定的色譜條件下，注入供試品溶液，記錄色譜圖，得出理論塔板數(shù)n=10665；分離度R=2.75，大于1.5。符合要求。見圖2。

圖2 改進(jìn)后的丁酸氫化可的松液相色譜圖

按照2010版《中國藥典》采用水-乙腈-冰醋酸（55︰45︰0.5）為流動相，檢測波長為240nm，進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示其檢出信號少，有漏檢或少檢的可能。見圖3。

2.3.6 檢測限配制一定濃度的丁酸氫化可的松樣品溶液，用流動相逐級稀釋，進(jìn)樣，按3倍信噪比計算，測得丁酸氫化可的松最低檢測限約為0.2ng·mL-1。

2.3.7 穩(wěn)定性考察取本品適量，加流動相制成每1 mL中約含0.1 mg的溶液，作為供試品溶液，置室溫自然條件下放置（避免強光照射），于不同時間，分別進(jìn)樣20 μL，記錄色譜圖，考察溶液的穩(wěn)定性，結(jié)果表明，在4 h內(nèi)測定液基本穩(wěn)定。

2.3.8 精密度試驗在選定的色譜條件下，取供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，量取峰面積，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=1.12%，小于2%，符合規(guī)定。

2.3.9 破壞性試驗取本品（批號20090401）進(jìn)行強酸、強堿和氧化等破壞性試驗，以峰面積歸一化法，計算雜質(zhì)含量。試驗的目的是考察所設(shè)定的液相色譜條件，是否能有效地分離雜質(zhì)，檢出分解產(chǎn)物。

原溶液的配制 精密稱取本品原料藥25.5 mg，置25 mL量瓶中，甲醇-四氫呋喃（4︰1）溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密量取續(xù)濾液5 mL置50 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。進(jìn)樣，記錄色譜圖，作為0時對照。雜質(zhì)總量為0.39%。

酸破壞 稱取本品約25mg，置25mL量瓶中，加入5mol·L-1鹽酸溶液適量，放置 2h，加甲醇-四氫呋喃（4︰1）溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過；精密量取續(xù)濾液5mL置50mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，制成每1mL中含0.1mg的供試液，進(jìn)樣，記錄色譜圖，見圖4A。試驗結(jié)果表明，本品經(jīng)酸破壞后測定，主峰與雜質(zhì)峰及降解產(chǎn)物峰均有良好的分離。

堿破壞 稱取本品約25mg，置25mL量瓶中，加入5mol·L-1氫氧化鈉溶液適量，放置2h，加甲醇-四氫呋喃（4︰1）溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過；精密量取續(xù)濾液5mL置50mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，制成每1mL中含0.1mg的供試液。進(jìn)樣，記錄色譜圖，見圖4B。試驗結(jié)果表明，本品經(jīng)堿破壞后，主峰與雜質(zhì)峰及降解產(chǎn)物峰均有良好的分離。

氧化破壞 稱取本品約25 mg，置25 mL量瓶中，加30%H2O2溶液適量，振搖使破壞，加甲醇-四氫呋喃（4︰1）溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過；精密量取續(xù)濾液5 mL置50 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL中含0.1 mg的供試液，見圖4C。試驗結(jié)果表明，本品經(jīng)氧化破壞后測定，主峰與雜質(zhì)峰及降解產(chǎn)物峰均有良好的分離。

上述試驗結(jié)果，可以證明本品所建立的液相色譜條件與系統(tǒng)適用性良好，能有效地監(jiān)控產(chǎn)品質(zhì)量。

2.3.10 色譜圖記錄時間的考察依據(jù)本品原料藥和強烈破壞性試驗結(jié)果，色譜圖記錄至主成分峰保留時間的3倍即可，大約在30分鐘各組分已被洗脫完畢。

2.3.11 樣品雜質(zhì)總量的測定色譜條件與系統(tǒng)實用性試驗：用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，0.02mol·L-1磷酸二氫鉀溶液（用磷酸調(diào)節(jié)pH 值至3.5）-甲醇-四氫呋喃（20︰65︰15）為流動相，檢測波長314 nm，理論板數(shù)以丁酸氫化可的松峰計算不低于2000。

測定法：取本品約25 mg，精密稱定，置25 mL量瓶中，加甲醇-四氫呋喃（4︰1）溶解并稀釋至刻度，搖勻，再加流動相稀釋10倍作為供試品溶液；精密量取供試品溶液適量，用流動相稀釋成每1 mL中含10 μg的溶液，作為對照溶液。精密量取供試品溶液與對照溶液各20 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分色譜峰保留時間的3倍，供試品溶液色譜圖中如有雜質(zhì)峰，量取各雜質(zhì)峰面積，計算有關(guān)物質(zhì)的量。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[S].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005.

[2] 中國藥品生物制品檢定所.中國藥品檢驗標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2005：128.

[3] 劉文英.藥物分析[M].第6版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2007：83.