紫外分光光度法測定毛雞骨草提取物中總黃酮含量*

王麗麗，杜慧斌，葉志文，張曉琦，汪 豪,**，葉文才,

1中國藥科大學(xué) 天然藥物化學(xué)教研室,南京 210009；2廣西玉林制藥有限責(zé)任公司，玉林537001；3暨南大學(xué) 中藥及天然藥物研究所，廣州 510632

毛雞骨草為豆科相思子屬植物Abrus mollis Hance的干燥全草。本品具有清熱利濕、舒肝止痛、活血散瘀的功效，臨床用于治療急慢性肝炎、肝硬化腹水、胃痛、風(fēng)濕痹痛等癥[1]。毛雞骨草，又名大葉雞骨草，為廣西特產(chǎn)藥材，是中藥名優(yōu)產(chǎn)品雞骨草膠囊的主要原料。本課題組藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究表明，廣西毛雞骨草治療肝病的主要藥效活性成分為芹菜素黃酮碳苷類化合物，即芹菜素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷等，毛雞骨草提取物是從毛雞骨草提取分離得到的總黃酮碳苷有效部位，該類化學(xué)成分具有保肝、降酶及降脂等藥效活性[2-3]?！吨袊幍洹?005年版一部未收載藥材雞骨草及含雞骨草制劑的含量測定方法。本文采用紫外分光光度法，以三氯化鋁為顯色劑，芹菜素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷為對照品（結(jié)構(gòu)式見圖1），測定毛雞骨草提取物中總黃酮含量，從而為其成方制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化研究提供依據(jù)。

圖1 芹菜素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷的結(jié)構(gòu)式

1 儀器與試藥

UV-2450型紫外可見分光光度計（日本島津）；Mettler Toledo XS105DU十萬分之一電子天平 （瑞士 Mettler Toledo）；PHS-3C 精密 pH 計(上海雷磁)。毛雞骨草提取物系毛雞骨草經(jīng)大孔吸附樹脂工藝分離純化得到；芹菜素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷為中國藥科大學(xué)天然藥物化學(xué)教研室自制，對照品純度＞98%(HPLC-UV法,面積歸一化法)[4]。其他所用試藥與溶劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

對照品溶液：精密稱取芹菜素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷適量，加甲醇制成0.20 mg·mL-1的溶液，即得。

供試品溶液的制備：取毛雞骨草提取物約10mg，精密稱定，置25mL量瓶中，加甲醇10 mL超聲使溶解，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

顯色試劑和緩沖液的配置：精密稱取三氯化鋁1.34g，加甲醇溶解并定容至100mL，配成0.1mol·L-1的溶液；精密稱取醋酸鈉1.64g，加雙蒸水溶解并定容至100 mL，配成0.2mol·L-1的溶液；精密量取1.15mL冰醋酸，加雙蒸水稀釋至100mL，配成0.2mol·L-1的醋酸溶液[5]。

2.2 測定波長的選擇

精密量取芹菜素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷對照品溶液1 mL置25 mL量瓶中，加入2 mL 0.1 mol·L-1的三氯化鋁溶液與2 mL pH5.2的醋酸鈉/醋酸緩沖液，各加甲醇稀釋至刻度，搖勻，40°C水浴10min，室溫放置10min，同法制得供試品溶液和空白液，按紫外-可見分光光度法（《中國藥典》2005年版一部附錄VA）試驗，在200～500 nm范圍內(nèi)進行掃描，記錄紫外吸收光譜，見圖2。

圖2 對照品（A）和供試品（B）顯色前后的紫外吸收光譜

結(jié)果表明，對照品和供試品溶液顯色后均在343、382nm處分別有最大吸收，但兩種溶液顯色前382nm處的吸收度均較小，故選擇382nm為測定波長。

2.3 線性關(guān)系考察

精密量取芹菜素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷對照品溶液 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL，余同“2.4”項操作，在382 nm波長處測定吸光度，以對照品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為：Y=0.0229X-0.0012,r2=0.9999。結(jié)果顯示，對照品在 4.1～24.6 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4 重復(fù)性試驗

取本品同一毛雞骨草提取物6份，按“2.4”項下方法操作并計算含量，含量均值為74.2%，RSD=2.12%，表明本法重現(xiàn)性較好。

2.5 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的毛雞骨草提取物5份 （總黃酮含量：74.2%），各精密加入芹菜素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷對照品適量，制備供試品溶液并按“2.4”項下方法操作，計算加樣回收率，回收率均值為101.3%，RSD=2.6%。結(jié)果見表1，表明本法準(zhǔn)確度較好。

2.6 樣品測定

取本品毛雞骨草提取物5批樣品，按“2.4”項下方法操作并計算含量，結(jié)果見表2。

3 討 論

黃酮類化合物分子中含有 3-羥基-4-酮基、5-羥基-4-酮基或鄰二酚羥基等基團時可以與鋁鹽絡(luò)合，并引起相應(yīng)的吸收帶紅移。毛雞骨草提取物中的主要活性成分為芹菜素黃酮碳苷類化合物，該類化合物的5-羥基-4-酮基與鋁鹽絡(luò)合，顯色后在382 nm處有最大紫外吸收，且顯色前的背景吸收度較小，可以避免非黃酮類化學(xué)成分的測試干擾。單因素考察不同顯色劑用量 （0.1 mol·L-1三氯化鋁1.0、2.0、4.0 mL），顯色溫度（30、40、50℃），緩沖液pH（5.0、5.2、5.4、6.0），以“2.4”項采用的條件最好。本測定方法簡便、準(zhǔn)確，專屬性較強，適用于毛雞骨草提取物及含毛雞骨草制劑的總黃酮含量測定。

表1 加樣回收率試驗

表2 毛雞骨草提取物總黃酮含量測定結(jié)果(n=3)

[1] 《中華本草》編委會.中華本草[M].第4卷.上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社,1999:303-5.

[2] 劉卓偉，闕兆麟，葉志文，等.毛雞骨草地上部分的化學(xué)成分[J].中國天然藥物，2008，6(6):415-7.

[3] 汪 豪，熊 非，劉卓偉，等.黃酮碳苷類化合物在治療和預(yù)防肝炎藥物中的應(yīng)用[P].中國，200710134589.4.2008-04-16.

[4] 寧麗娟，汪 豪，葉文才，等.毛雞骨草中芹菜素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷對照品的制備分離及鑒定[J].

中草藥，2010，41(8):1905-7.

[5] 丁明玉，趙紀(jì)萍，李擎陽.貫葉金絲桃提取物中總黃酮的測定方法[J].分析實驗室，2001，20(6):45-7.