外源性硫化氫對異丙腎上腺素誘導(dǎo)的大鼠急性心肌缺血的保護(hù)作用

郭一塵 程東升 劉穎璐 周榮 魯彥

心血管疾病是全世界危害人類生命健康最嚴(yán)重、最普遍的疾病，其患病率占各類疾病之首，病死率僅居于惡性腫瘤之后，成為影響人類健康和制約社會和經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重要因素之一。內(nèi)源性硫化氫(H2S)是新近發(fā)現(xiàn)的繼一氧化氮和一氧化碳的第三類氣體信號分子，具有舒張血管、降低血壓、抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖、心肌負(fù)性肌力等多種心血管效應(yīng)，并在動脈粥樣硬化、高血壓、心肌缺血等多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中具有重要的病理生理意義[1～5]。Geng等[6～8]研究者已通過在體和離體實(shí)驗(yàn)，通過結(jié)扎大鼠冠狀動脈左前降支，證實(shí)硫化氫對局部缺血再灌注損傷大鼠心臟有明確的保護(hù)作用，而硫化氫對異丙腎上腺素(ISO)誘導(dǎo)的大鼠急性全心缺血損傷是否也具有同樣顯著的保護(hù)作用，目前國內(nèi)外相關(guān)研究文獻(xiàn)報(bào)道很少，故筆者采用ISO制備大鼠急性心肌缺血模型，觀察外源性硫化氫對急性心肌缺血大鼠心電圖和心臟血清酶學(xué)的影響，為進(jìn)一步探討硫化氫在心肌缺血疾病中的作用機(jī)制提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)藥品:NaHS(外源性H2S供體，購自Sigma公司)，實(shí)驗(yàn)時(shí)用生理鹽水制成 50mmol/L濃度[9]。ISO由上海禾豐制藥有限公司生產(chǎn)，批號:100501，規(guī)格:2ml:1mg。烏拉坦購自BIO BASIC INC公司。

2.實(shí)驗(yàn)動物與分組:清潔級雄性SD大鼠18只，體質(zhì)量200～250g，購自蘭州大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心(動物合格證SCXR(甘)(2005-0007)。

3.實(shí)驗(yàn)方法:(1)造模:參考文獻(xiàn)[10]方法，采用皮下多點(diǎn)注ISO(10mg/kg)方法制備大鼠急性心肌缺血模型。皮下注射ISO 40min后，將實(shí)驗(yàn)大鼠用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的烏拉坦(50mg/kg)腹腔麻醉后，仰臥固定于手術(shù)臺，分離大鼠任意一側(cè)股靜脈，置入股靜脈導(dǎo)管。四肢安插針狀電極，標(biāo)定增益1000、濾波100Hz、電壓50V，描記Ⅱ?qū)?lián)心電圖。(2)實(shí)驗(yàn)方法:將大鼠隨機(jī)分為3組:正常對照組，模型組，NaHS組，每組6只大鼠。皮下注射ISO后1h，正常對照組與模型組均通過股靜脈導(dǎo)管注射生理鹽水(0.1ml/100g)，NaHS組注射NaHS 50mmol/L(0.1ml/100g)[9]。各組大鼠在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后經(jīng)頸總動脈取血，離心后測血清中ALT、AST、CK及CK-MB。(3)檢測方法:實(shí)驗(yàn)中大鼠Ⅱ?qū)?lián)心電圖由RM6240BD型多道生理信號采集處理系統(tǒng)記錄(成都儀器廠)。各組大鼠在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后經(jīng)頸總動脈取血，3000r/min離心20min后分離血清。(4)觀察指標(biāo)及統(tǒng)計(jì)分析:連續(xù)記錄并觀察給藥后70min大鼠心電圖變化。同時(shí)，檢測各組血清中ALT、AST、CK及CKMB。所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用 SPSS 16.0版統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，多組間兩兩比較用單因素方差分析，P＜0.05為差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.靜脈注射NaHS對急性心肌缺血大鼠心電圖的影響:皮下注射ISO 10min后，大鼠心電圖ST段開始明顯下降，和對照組大鼠比較有顯著性差異(P＜0.05)，提示造模成功。皮下注射ISO后對大鼠心電圖P、QRS波和T波無明顯影響。股靜脈注射NaHS溶液(50mmol/L)能明顯改善大鼠心肌缺血。靜脈注射NaHS 10min后大鼠心電圖開始抬高，70min基本恢復(fù)正常，與模型組比較差異有顯著性(P＜0.05)。皮下注射生理鹽水不影響大鼠心電圖。靜脈注射等容積生理鹽水也不影響模型組大鼠心電圖(表1)。

表1 靜脈注射NaHS(50 mmol/L)對ISO誘導(dǎo)的急性缺血大鼠心電圖ST段的影響

表1 靜脈注射NaHS(50 mmol/L)對ISO誘導(dǎo)的急性缺血大鼠心電圖ST段的影響

與正常對照組比較，*P＜0.05;與模型組比較，#P＜0.05

10min 30min 50min 70min正常對照組組別 n大鼠心電圖ST段0.04±0.04 0.01±0.04 0.01±0.05 0.01±0.05模型組 6 -0.21±0.20* -0.18±0.16* -0.19±0.17* -0.20±0.18*NaHS組 6 -0.19±0.11* -0.09±0.06 -0.01±0.06# -0.04±0.086#

2.NaHS對急性心肌缺血大鼠血清酶的影響:模型組大鼠血清中ALT、AST、CK及CK-MB顯著高于正常對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。NaHS組大鼠血清中ALT、AST、CK及CK-MB與模型組比較顯著降低(P＜0.05)(表2)。

表2 各組大鼠血清酶測定結(jié)果(U/L，)

表2 各組大鼠血清酶測定結(jié)果(U/L，)

與正常對照組比較，*P＜0.05;與模型組比較，#P＜0.05

ALT AST CK CK-MB正常對照組 6 54.3±7.6 164.2±22.5 5044.4±758.3 1516.3±2組別 n 14.8模型組 6 120.1±11.0* 306.4±57.7* 10076.2±2672.6* 2688.4±477.5*NaHS組 6 61.9±10.7# 172.3±37.4# 6872.7±1517.8# 1773.3±397.2#

討 論

冠心病的病理發(fā)展過程早期，致冠心病危險(xiǎn)因素造成血管內(nèi)皮功能損害，不僅NO產(chǎn)生減少，內(nèi)源性H2S的產(chǎn)生也明顯減少;在冠心病病理發(fā)展的晚期，不穩(wěn)定型心絞痛和急性心肌梗死患者中，一方面冠狀動脈粥樣硬化程度更加嚴(yán)重，內(nèi)皮分泌功能進(jìn)一步紊亂，另外冠狀動脈嚴(yán)重痙攣、血栓形成，使心肌細(xì)胞處于缺氧狀況，兩者均可能導(dǎo)致血漿H2S的濃度進(jìn)一步降低[11]。H2S作為氣體信號分子在生理或病理狀態(tài)下調(diào)節(jié)血管平滑肌的張力和心臟的收縮功能，當(dāng)內(nèi)源性H2S不足時(shí)則出現(xiàn)血管平滑肌舒張功能下降，平滑肌細(xì)胞增殖凋亡，心臟肌力升高，從而導(dǎo)致冠心病的發(fā)生[5]。

最近有研究發(fā)現(xiàn)，在ISO誘發(fā)的大鼠心肌缺血模型中，血漿H2S水平明顯下降，心肌胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)活性下調(diào)，CSE基因表達(dá)顯著增多。而外源性給予H2S供體NaHS后，不僅可降低心肌缺血大鼠的病死率，改善左室功能，而且可減少白細(xì)胞的黏附、心肌纖維原細(xì)胞的增生和肥大以及脂質(zhì)過氧化作用，這些均表明H2S在冠心病的發(fā)病過程中可能起重要保護(hù)作用[11～13]。

大劑量ISO可誘導(dǎo)大鼠發(fā)生急性心肌缺血，其致心肌缺血性損傷的漸進(jìn)性，心電圖和酶學(xué)變化均類似于人類心肌急性缺血或心肌梗死[12，13]。本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M大鼠經(jīng)皮下多點(diǎn)注射ISO 1h后，心電圖Ⅱ?qū)?lián)ST段較正常對照組明顯降低，說明急性心肌缺血模型成功。大鼠在給予外源性硫化氫供體NaHS后，明顯減輕ISO誘導(dǎo)的大鼠心肌缺血程度，大鼠心電圖ST段逐漸抬高，給藥30min后ST段基本恢復(fù)至正常水平，并一直持續(xù)到實(shí)驗(yàn)結(jié)束。經(jīng)外源性硫化氫(NaHS)治療的大鼠血清中ALT、，AST、CK和CK-MB水平明顯低于未經(jīng)治療的模型組大鼠。心電圖ST段的恢復(fù)和血清中ALT、AST、CK和 CK-MB含量的顯著降低，均提示外源性硫化氫對急性心肌缺血大鼠心臟有較好的保護(hù)作用。

目前研究認(rèn)為內(nèi)源性硫化氫參與心肌缺血的保護(hù)機(jī)制可能主要與抑制炎癥反應(yīng)，減輕心肌細(xì)胞損傷;調(diào)節(jié)血管張力，舒張血管，改善心肌供血;減慢機(jī)體代謝，減少氧耗，降低心肌做功[14];促進(jìn)血管生成和內(nèi)皮再生以及抑制血小板聚集等機(jī)制有關(guān)[15，16]。Cai等[17]研究表明，內(nèi)源性H2S是血液系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)因子。同NO相似，外源性NaHS(H2S供體)能抑制膠原、二磷酸腺苷(ADP)、腎上腺素、花生四烯酸、凝血酶誘導(dǎo)的人類血小板聚集，降低血液黏度。

近年的研究已表明，內(nèi)源性H2S能夠通過抑制炎癥反應(yīng)、減輕鈣超載、減少細(xì)胞凋亡、保護(hù)線粒體等多種途徑減少心肌缺血梗死面積，挽救存活心肌，恢復(fù)心肌功能，且能抑制血管平滑肌細(xì)胞增生，逆轉(zhuǎn)血管重構(gòu)，促進(jìn)受損內(nèi)皮細(xì)胞修復(fù)。本實(shí)驗(yàn)給予外源性硫化氫(NaHS)治療ISO誘導(dǎo)的大鼠急性心肌缺血，所得到的顯著心肌保護(hù)作用與其在局部缺血再灌注損傷中的保護(hù)作用一致，這說明外源性硫化氫不僅對大鼠局部心肌缺血有明確的保護(hù)作用，而且對由ISO誘導(dǎo)的大鼠急性全心缺血同樣具有明顯的保護(hù)作用。

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