不同負(fù)荷運動訓(xùn)練對大鼠大腦皮質(zhì)軀體感覺區(qū)神經(jīng)型一氧化氮合酶活性的影響

李浩旭 劉江靜 魯 彥 李保利

不同負(fù)荷運動訓(xùn)練對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響是運 動醫(yī)學(xué)研究的熱點之一，特別是中樞神經(jīng)疲勞時腦內(nèi)某些神經(jīng)遞質(zhì)或信號分子的變化[1，2]。研究表明一氧化氮(NO)是一種氣體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，介導(dǎo)神經(jīng)傳遞過程，并參與血管調(diào)節(jié)和免疫反應(yīng)[3]。目前雖然有文獻(xiàn)報道運動能對腦組織中一氧化氮合酶(NOS)及其亞型表達(dá)有一定的影響，但不同負(fù)荷的運動對皮質(zhì)軀體感覺區(qū)神經(jīng)型一氧化氮合酶(nNOS)表達(dá)的影響目前尚未報道[4]。我們對大鼠進(jìn)行了為期8周不同負(fù)荷的運動訓(xùn)練，通過測定大鼠皮質(zhì)軀體感覺區(qū)nNOS表達(dá)強(qiáng)度，探討不同負(fù)荷運動訓(xùn)練對機(jī)體軀體感覺區(qū)中nNOS活性的影響，并研究其生物學(xué)意義。

材料與方法

1.實驗動物分組:3月齡健康雄性SD大鼠60只，體重200～230g，(由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部動物中心提供)。隨機(jī)分成3組，正常對照組(NC，20只)，一般負(fù)荷組(MT，20只)，過度負(fù)荷組(OT，20只)。標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動物飼料喂養(yǎng)，自由飲水，室溫約20℃，濕度(45±10)%，通風(fēng)良好，自然照明。

2.訓(xùn)練模型:參照改動的Beford運動負(fù)荷標(biāo)準(zhǔn)對大鼠進(jìn)行動物跑臺訓(xùn)練。跑道長58cm，寬8.5cm;跑臺坡度為10°，每周訓(xùn)練6天，每日1次，共訓(xùn)練8周。SC組大鼠按常規(guī)喂養(yǎng)，自由活動、飲食，不進(jìn)行任何訓(xùn)練;MT組大鼠第1周每天完成10m/min×10min的跑臺運動;第2周每天完成10m/min、15m/min各10min的跑臺運動;第3周，每天進(jìn)行10m/min、15m/min、20m/min各 10min的跑臺運動;第 4周后每天進(jìn)行10m/min、15m/min、20m/min和 25m/min各 10min的跑臺運動，并維持此負(fù)荷直至實驗結(jié)束。OT組前4周運動負(fù)荷同一般訓(xùn)練組，從第5周開始，進(jìn)行4周遞增負(fù)荷跑臺運動，每天以 10m/min、15m/min、20m/min、25m/min 各 10min 運動后，加速至30m/min、35m/min，并延長運動時間，直至大鼠力竭[1，2]。

3.取材與制片:訓(xùn)練8周后，各組大鼠稱重，25%烏拉坦(0.6ml/100mg)麻醉，仰臥位固定于手術(shù)臺，開胸，暴露心臟，經(jīng)心尖插管入主動脈內(nèi)。取0.5ml血液置于預(yù)先包裹EDTA-LK2試管內(nèi)，專人顯微鏡下計數(shù)紅細(xì)胞數(shù)目。大鼠經(jīng)插管灌注生理鹽水沖洗并經(jīng)4%多聚甲醛固定后，開顱取出大腦。4%多聚甲醛4℃固定24h后再用自來水沖洗24h，乙醇脫水、二甲苯脫脂。將大腦中央后回做冠狀切開，60℃下石蠟包埋后切片(片厚5μm)，切片貼于經(jīng)10g/L明膠+0.5g/L硫酸錳鉀處理過的玻片上。再脫臘完成后浸入0.01mol/L的PBS(pH7.4)，100%甲醇+3mol/LH2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶，PBS浸洗3×5min后再浸泡于3g/L TritonX-100中30mi，切片入正常山羊抗血清30min，加NOS抗體血清(1∶100，北京中山公司，4℃孵育24h，再PBS浸洗3×10min后入結(jié)合生物素的兔抗羊第二抗體中室溫孵育1h，BS浸洗3×10min，ABC復(fù)合物(1∶200)室溫孵育1h之后顯色，常規(guī)脫水透明，DPX封片。對照實驗用PBS代替第一抗體。間隔3張取2片，切片進(jìn)行免疫組化ABC法染色:入含0.3%Triton X-100，10%正常羊血清，37℃的1∶500的兔抗2h。4℃冰箱內(nèi)60h以上后再入37℃的1∶200的羊抗兔 lgG 1h后用0.05%DAB/H2O2顯色。以上各步驟間均用0.01mol/L PBS(pH7.4)漂洗3次，每次5min。常規(guī)裱片，脫水，透明，封片。

4.nNOS測定:切片置OlympusB-2光學(xué)顯微鏡下，用低倍鏡(4×10)定位，每套切片隨機(jī)等距抽取10張切片，每張切片中，隨機(jī)抽取5個視野。根據(jù)nNOS陽性染色細(xì)胞選擇合適的門限分割值，采用雙門限分割成半灰度圖，然后測量每一個視場單個陽性細(xì)胞的nNOS的相對含量，測量單位用AU。用MPIAS-500多媒體彩色病理圖文分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，每個切片隨機(jī)取10個視野，計算每個視野陽性反應(yīng)產(chǎn)物的平均灰度值。酶著色越深，其灰度值越小，說明NOS陽性表達(dá)越強(qiáng)。

結(jié) 果

1.一般情況觀察:在訓(xùn)練的前4周，3組大鼠神態(tài)安靜，性情溫順，活潑好動，皮毛光亮整潔。從第5周末開始，OT組大鼠精神倦怠，雙目無光，少活動，易激惹。訓(xùn)練結(jié)束后，對照組和一般負(fù)荷組大鼠神態(tài)安靜，皮毛光整，雙目有神;OT組大鼠神態(tài)倦怠，精神萎靡，食量下降，反應(yīng)降低，眼睛暗淡無光，毛發(fā)脫落明顯。

2.體重變化:實驗后3組大鼠體重均較實驗前增長:第四周MT組大鼠體重與SC和OT組比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)，第八周MT組和SC組比較沒有顯著性差異，但OT組大鼠體重與SC組(294.22±26.54g vs 366.85±40.34g，P＜0.05)和 MT組(294.22±26.54g vs 366.85±40.34g，P ＜0.05)比較均有顯著性差異。說明適量的運動雖然可以控制體重，但對體重影響不大;過度運動可導(dǎo)致體重嚴(yán)重減輕(表1)。

表1 不同運動負(fù)荷對大鼠體重的影響

3.不同運動負(fù)荷對大鼠紅細(xì)胞數(shù)量的影響(表2)。與實驗期比較，3組大鼠紅細(xì)胞數(shù)量均有增加，8周后，OT組大鼠紅細(xì)胞數(shù)目反而下降，與SC組比較有顯著性差異[(4.21±0.46)×1012/L vs(5.87±0.31)×1012/L，P＜0.05]，但 MT組大鼠紅細(xì)胞數(shù)目與SC組比較沒有顯著性差異。

表2 不同運動負(fù)荷對大鼠紅細(xì)胞數(shù)量的影響(1012/L)

4.不同運動負(fù)荷對大鼠皮質(zhì)nNOS表達(dá)的影響(表3)。安靜狀態(tài)下，SC組的平均灰度值明顯大于MT組(121.33±20.14AU vs 74.90±23.75AU，P＜0.05)和OT組(121.33±20.14AU，P＜0.05);MT組的平均灰度值與OT組比較無顯著性差異(74.90±23.75AU vs 72.78±26.63 AU，P ＞0.05)。

表3 大鼠大腦皮質(zhì)軀體感覺區(qū)nNOS平均灰度值(AU)

討 論

我們的研究表明，運動能使大鼠體重增長，紅細(xì)胞數(shù)目增加，但長期過度負(fù)荷運動反而降低大鼠體重，并減少大鼠紅細(xì)胞數(shù)目。運動能使大鼠皮質(zhì)nNOS表達(dá)增加，增加的數(shù)量和運動量沒有關(guān)系。運動能使大鼠大腦皮質(zhì)軀體感覺區(qū)nNOS表達(dá)增多，活性增強(qiáng)。超負(fù)荷運動組與一般負(fù)荷組比較，整個大腦皮質(zhì)軀體感覺區(qū)神經(jīng)元型一氧化氮合酶沒有明顯增高，說明運動負(fù)荷的大小與nNOS含量的多少沒有顯示出必然的聯(lián)系。

nNOS主要分布于不同物種動物的大腦皮質(zhì)、海馬、紋狀體、下丘腦、中腦和小腦等處。在大腦皮質(zhì)，含有nNOS的神經(jīng)元占約為2%左右[5，6]。NO是一種特殊的神經(jīng)遞質(zhì)，也是一種重要的氣體信號傳導(dǎo)分子，參與突觸傳導(dǎo)過程。NO/環(huán)鳥苷酸(NO/cGMP)途徑是NO參與神經(jīng)傳遞和發(fā)揮其他多種生物學(xué)效應(yīng)的主要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。中樞神經(jīng)系統(tǒng)NO還可以影響其他神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，研究報道，在大腦皮質(zhì)神經(jīng)元，NO供體硝普鈉、S-亞硝基-乙酰青酶胺可誘導(dǎo)γ-氨基丁酸(GABA)或乙酰膽堿(Ach)的釋放[7]。

此外，一氧化氮還可使N-甲基-D-天冬胺酸(NMDA)受體分子中的巰基發(fā)生亞硝?；饔?，阻斷該受體的過度興奮，減少鈣離子內(nèi)流，從而減輕神經(jīng)元的興奮性毒性損害，起到了保護(hù)神經(jīng)元的作用[8，9]。大腦皮質(zhì)軀體感覺區(qū)神經(jīng)元的胞核和棘突的增大對信息的傳遞起重要作用。這些區(qū)域nNOS的增多，使NO合成的速度和濃度增加，合成后的NO快速擴(kuò)散作用于靶細(xì)胞，發(fā)揮作用，影響神經(jīng)元對信息的傳遞，進(jìn)而影響神經(jīng)元功能的發(fā)揮[10，11]。運動能提高大腦皮質(zhì)nNOS表達(dá)，這可能是運動能提高動物運動靈活性，并延長壽命，防止人類老年癡呆的重要原因。

1 Criswell DS，Henry KM，DiMarco NM，et al.Chronic exercise and the pro-inflammatory response to endotoxin in the serum and heart.Immunol Lett[J].2004，95(2):213-220

2 Kalesnykas G，Puolivali J，Sirvio J，et al.Cholinergic neurons in the basal forebrain of aged mice[J].Brain Res，2004，1022:148-156

3 李翠珍，賈靜.力竭游泳對大鼠紅細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化及紅細(xì)胞變形性的影響[J].中國臨床康復(fù)，2005，7(28):198-199

4 Ohkuma S，Narihara H，Katsura M，et al.Nitric oxide-induced[3H]GAGB release from cerebral cortical neuron is mediated by peroxynitrite[J].J Neurochem，1995，65:1109

5 李寧川，陳曉鶯，孫新榮.力竭運動對大鼠腦組織中微量元素含量及抗氧化酶活性的影響[J].體育與科學(xué)，2003;24(1):41-43

6 Grandfield A，LeferDJ，Vinten Johansen J.Protective ischemia in patients:p reconditioning and postconditioning[J].Cardiovasc Res，2009，83(2):234-246

7 Schulz R，KelmbM，Heusch G.Nitric oxide in myocardial ischemia/reperfusion injury[J].Cardiovasc Res，2004，61:402-413

8 夏志，汪清祥，黃濤，等.一氧化氮和一氧化氮合酶與運動訓(xùn)練[J].首都體育學(xué)院學(xué)報[J]，2009，21(1):83-87

9 劉美娟，王蓬偉，林松娟.慢性阻塞性肺疾病肺動脈壓和一氧化氮合酶的變化.中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志[J]，2008，21(18):3179-3181

10 馬瑞，周建平，肖明，等.大鼠耳神經(jīng)節(jié)和基底動脈壁神經(jīng)纖維一氧化氮合酶表達(dá)的增齡變化.解剖學(xué)雜志[J]，2009，32(1):79-81

11 Prattico F，Perfet ti P.Images in clinical medicine Freyps syn2drome[J].N Engl J Med，2006，355(1):66