慢性乙型肝炎患者外周血CD4+CD25+調節(jié)性T細胞數量與肝臟疾病慢性化進展關系的研究

程 瑗 金曉芝 葉 超 陳永平 章圣輝 洪煒龍 谷甸娜 張 磊 鄭明華

乙型肝炎病毒(HBV)感染呈世界性分布，我國是慢性乙型病毒性肝炎(CHB)的高發(fā)區(qū)，慢性HBV感染導致肝臟持續(xù)損傷、肝纖維化，并可進一步發(fā)展成為肝硬化以及肝癌。CHB的發(fā)病機制十分復雜，其中宿主免疫調節(jié)的紊亂是導致機體不能有效清除病毒的重要原因之一[1]。

CD4+CD25+調節(jié)性T細胞(Treg)是一類具有調節(jié)功能的T細胞群體，能夠分泌細胞因子TGF-β1等，通過調節(jié)外周免疫耐受來控制效應T細胞的免疫反應。有學者認為Treg在慢性HBV感染時宿主免疫反應缺陷的過程中起了重要作用[2]，目前國內外關于Treg與HBV感染的研究中大多數研究結果發(fā)現Treg在慢性活動性乙型肝炎(chronic active hepatitis)及ASCs患者外周血中的數量較正常人升高，研究中大都選擇了未經抗病毒治療的急慢性乙型病毒性肝炎患者來觀察，關于接受抗病毒治療后的CHB患者外周血中Treg的數量和功能研究不多，且關于Treg跟HBV感染者各臨床參數之間的相關性的結果仍存在較大爭議[2～6]。此次，我們收集了45例應用核苷類似物抗病毒藥治療后HBV-DNA低于檢測值水平的CHB患者外周血，并按B超檢查結果將患者分為3組，其中單純CHB、CHB慢性肝病、CHB肝硬化患者各15例，與15例ASCs者以及15例正常成年人對照，觀察CD4+CD25+Treg細胞在這部分患者外周血中的數量變化情況，并分析Treg與患者年齡，HBeAg定量、ALT、AST以及血漿TGF-β1水平的相關性。

材料與方法

1.研究對象:CHB患者45例，ASCs者15例，所有病例均為2009年10月～2010年7月筆者醫(yī)院門診患者，符合2000年西安會議修訂的《病毒性肝炎防治方案》診斷分型標準，所有患者均除外其他病毒性肝炎、酒精性肝病、藥物性肝炎、自身免疫性肝病、遺傳性肝病等[7]。根據B超檢查結果我們將45例CHB患者分為3組，其中單純CHB15例(B超提示肝膽脾胰無異常)，CHB慢性肝病15例(B超提示慢性肝病改變)，CHB肝硬化15例(B超提示肝硬化)。15例單純CHB患者，男性9例，女性6例，年齡25～65歲，平均42.60±10.02歲，15例CHB慢性肝病患者，男性9例，女性6例，年齡25～65歲，平均44.40±11.19歲;15例CHB肝硬化患者，男性10例，女性5例，年齡28～65歲，平均46.00±10.97歲。15例ASCs者，男性9例，女性6例，年齡25～65歲，平均41.47±11.09歲。15例正常對照者為筆者醫(yī)院健康體檢者，男性9例，女性6例;年齡25～65歲，平均43.73±11.24歲，均無肝炎病史，除外病毒性肝炎、酒精性肝病、藥物性肝炎、自身免疫性肝病、遺傳性肝病等，肝功能均正常。45例應用核苷類似物抗病毒治療病人的用藥時間為1～5年，HBV-DNA均低于檢測值水平，且血清ALT、AST均在正常范圍內，其中使用拉米夫定13例，阿德福韋酯11例，替比夫定9例，恩替卡韋7例，另有5例病人為拉米夫定加阿德福韋酯聯合抗病毒。所有病人近6個月內均未接受免疫調節(jié)劑及保肝降酶或抗纖維化藥物治療。

2.實驗方法:(1)主要試劑和儀器:美國BD FACS流式細胞儀，小鼠抗人 CD4-FITC、CD25-PE、CD127-Alexa Fluor?647、mouse IgG1-PE、mouse IgG1-APC 均購自美國 BD Pharmingen公司。SEMENS公司全自動生化分析儀進行肝功能檢測。HBV-DNA采用熒光定量-聚合酶鏈反應技術檢測，按深圳匹基生物工程股份有限公司試劑盒說明書進行操作。ELISA檢測血漿TGF-β1水平，人TGF-β1ELISA試劑盒購自上海依科賽生物制品有限公司，按照說明書進行操作。(2)流式細胞術檢測外周血CD4+CD25+CD127lo/-Treg的水平:采集患者及健康體檢者外周靜脈血2ml，EDTA抗凝。同時取2個流式試管，分別加入CD4-FITC/mouse IgG1-PE/mouse IgG1-APC和CD4-FITC/CD25-PE/CD127-Alexa Fluor?647各 5μl，每管再加 40μl抗凝全血，混勻，避光孵育30min，2ml溶血素溶血，PBS洗滌2次，流式細胞儀檢測，CellQuest v3.2軟件獲取及分析，計算外周血中CD4+CD25+CD127lo/-Treg占CD4+淋巴細胞比例。

結 果

1.各組患者臨床特點及血清生化各相關指標及血漿TGF-β1水平檢測結果，如表1、表2所示。

表1 各組患者臨床特征及核苷類似物使用情況(n)

表2 各組患者臨床特征、各項生化指標及TGF-β1檢測結果

2.多色熒光分析法檢測外周血中CD4+CD25+CD127lo/-Treg的數量，如圖1所示。不同組患者外周血中CD4+CD25+CD127lo/-Treg水平的數量檢測結果，如表3所示。

圖1 外周血CD4+CD25+CD127lo/-Treg數量

表3 各組患者CD4+CD25+CD127lo/-Treg數量檢測結果比較()

表3 各組患者CD4+CD25+CD127lo/-Treg數量檢測結果比較()

a與健康對照組比較，其中a*P＜0.05，a＊＊P＜0.01;b與慢性HBV攜帶組比較;c與慢乙肝組比較，其中c*P＜0.05;d與慢乙肝肝纖維化組比較

3.不同組患者外周血CD4+CD25+CD127lo/-Treg數量與各指標的關系:相關系數及顯著性見表4。Treg數量與各項指標進行相關性分析顯示，在全部受檢者中Treg數量與年齡之間正相關(r=0.327，P=0.004)，與血清AST水平之間正相關(r=0.324，P=0.005)，與血漿 TGF-β1水平正相關(r=0.306，P=0.008)，相關性散點圖見圖2。而與 HBeAg定量，血清 ALT水平之間無顯著相關性(r分別為0.177、0.129，P 分別為 0.130、0.270)。

表4 Treg與不同組患者各項生化指標相關性分析

圖2 Treg與年齡、AST、TGF-β1相關性散點圖

4.各組 Treg、年齡、AST、TGF- β1水平比較:結果見圖3。

圖3 不同組Treg、年齡、AST、TGF-β1比較情況

討 論

HBV感染慢性化的機制比較復雜，其中機體免疫清除病毒的能力發(fā)揮極為重要的作用，它既能夠控制病毒的復制和清除、促臨床恢復和使機體產生保護性的免疫應答，也會導致炎癥損傷遷延不愈，肝纖維化發(fā)生，甚至發(fā)展為肝硬化、肝癌等。Treg的發(fā)現使人們對免疫調節(jié)及免疫耐受有了新的認識，機體可能更主要的是通過Treg以“主動”的方式維持自身免疫耐受，在機體發(fā)生一些病原微生物感染時，體內的CD4+CD25+Treg的數量可以增多，且可抑制CD4+T細胞和CD8+T細胞的活化和增殖及Th1/Th2細胞因子的分泌，從而影響機體抗感染免疫應答的發(fā)生，導致感染的持續(xù)[8]。CD4+CD25+Treg最基本的分子表達特征為持續(xù)穩(wěn)定表達CD25，Foxp3是CD4+CD25+Treg細胞分化發(fā)育和功能維持的重要調控基因，可作為人CD4+CD25+Treg細胞的特異性標志。但Foxp3屬胞內蛋白，標記后的細胞已被破壞不能用于進一步的培養(yǎng)和研究。Liu等發(fā)現CD127可以幫助識別CD4+CD25+Treg細胞與活化的T細胞，CD127的低表達與Foxp3表達極其一致且與CD25中等到強表達有良好的相關性，即真正的調節(jié)性T細胞僅表達較低的CD127，因此在CD4+CD25+基礎上聯合CD127 lo/- 可以更好地識別人 CD4+CD25+Treg 細胞[9，10]。

我們使用CD4+CD25+CD127lo/-來標記CD4+CD25+Treg細胞，檢測應用核苷類似物抗病毒治療后HBV-DNA低于檢測值水平，肝功能ALT、AST在正常范圍內的CHB患者，根據其B超檢測結果將其分為單純CHB，CHB慢性肝病及CHB肝硬化3組，并選擇同樣ALT、AST正常的ASCs患者和正常成年人一起作為對照來觀察這一部分患者外周血中CD4+CD25+Treg水平并分析其與患者年齡，HBeAg定量、ALT、AST、TGF-β1水平的相關性。

結果發(fā)現，在抗病毒治療后單純CHB患者外周血中CD4+CD25+Treg細胞數量較ASCs組顯著降低，與正常組沒有顯著差異，提示在HBV慢性感染的免疫調節(jié)中，Treg可能發(fā)揮了維持機體效應細胞免疫清除HBV的穩(wěn)態(tài)的作用，在ASCs患者中Treg的數量增加使得機體維持保護性免疫，避免激發(fā)過度的免疫反應所致的肝臟病理損傷的同時也造成病毒在機體的持續(xù)存在。而在抗病毒治療后隨著HBV DNA的清除，Treg數量也隨著致病因素的去除而相應下降，也表明當CHB患者自身免疫耐受打破后，Treg的數量或許可以一定程度上反映CHB患者體內HBV DNA的清除情況。

同樣抗病毒治療后的CHB慢性肝病患者及CHB肝硬化患者外周血中Treg數量較之健康對照者和抗病毒治療后CHB組顯著增高。且在所有受檢者中Treg的數量與年齡、血清AST水平、血漿TGFβ1水平正相關。我們比較了各組年齡、血清AST水平、血漿TGF-β1水平，發(fā)現各組年齡之間無顯著差異，單純CHB患者組的AST水平及TGF-β1水平則明顯低于CHB慢性肝病組和肝硬化組。

AST主要分布在肝細胞質和肝細胞的線粒體中，當肝臟發(fā)生嚴重壞死或破壞時，肝細胞的線粒體也遭到了嚴重的破壞，AST從線粒體和胞質內釋出，可以一定程度上反映肝臟損傷壞死情況。Treg在血清ALT、AST維持在正常范圍內的受試者中仍與AST存在顯著正相關，也提示Treg可能更能敏感的反應肝臟的損傷程度，當肝細胞出現嚴重損傷和壞死的時數量會增加，以阻止機體過度的免疫損傷引起的炎癥。慢性肝病進展過程中肝臟發(fā)生纖維化時中心環(huán)節(jié)是HSC的活化，最關鍵的細胞因子是TGF-β1。TGF-β1對HSC的增生活化具有極其重要的作用，是最強的促纖維化生成因子。早期肝損傷時，體內的炎性細胞如活化的巨噬細胞等能分泌大量細胞因子如TGF-β1、TNF-α、EGF、PDGF等，刺激 HSC 活化轉化為肌成纖維細胞;同時活化后的HSC可以自分泌TGF-β1、TNF-α等因子，促進自身進一步活化。而細胞因子之間通過各種細胞間的數種信號傳導通路可互相作用，一旦啟動，會產生級鏈瀑布式的效應，在炎癥后階段即使去除原來的肝損因素，也會導致肝纖維化形成的持續(xù)[11，12]。而Treg能夠分泌細胞因子TGF-β1，同時體外實驗研究也表明TGF-β1能夠誘導CD4+CD25-T向CD4+CD25+T細胞轉化以及促進Foxp3表達[13]。因此，我們推測存在在CHB組與CHB慢性肝病、肝硬化組之間血清AST和血漿TGF-β1水平的顯著差異，可能也是Treg在這3組存在顯著差異的原因。也表明低水平AST時Treg的增加更能提示肝臟慢性損傷程度。

對于Treg在抗病毒治療后的CHB慢性肝病、肝硬化患者外周血中仍增高的原因，我們推測，Treg可以敏感地反映存在于慢性肝病、肝硬化患者體內肝臟的炎癥損傷情況，保護肝臟避免過度免疫激發(fā)所致的病理損傷，同時Treg分泌的TGF-β1等可能促進了HSC的活化;或者通過細胞直接接觸與作為APC的HSC發(fā)生作用，促進肝纖維化發(fā)生;而在肝纖維化肝硬化時患者體內及HSC活化后肝臟局部的纖維化微環(huán)境中各種細胞因子，包括由活化后的HSC自分泌的TGF-β1等可能也促進了Treg的進一步增殖分化和發(fā)揮功能作用[11～15];或者以上幾種作用方式同時存在，并相互關聯，互為反饋，與其他致纖維化因素一起促進慢性肝病、肝硬化的形成。因此，Treg可能參與了慢性HBV感染后肝臟疾病慢性化進展的過程。我們將進一步配合肝活檢檢測慢性乙型肝炎肝纖維化、肝硬化患者肝組織中Treg的表達情況及動態(tài)觀測抗病毒治療過程中患者自身對照其外周血Treg數量的變化，并進行體外實驗來研究Treg在慢性HBV感染后對肝臟疾病慢性化進展中的具體作用和機制。

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