中藥鎮(zhèn)痛實驗的研究進展

王曉玲,樂 健,洪戰(zhàn)英,范國榮

(1.第二軍醫(yī)大學藥學院藥物分析學教研室,上海 200433;2.福建中醫(yī)藥大學藥學院,福州 350108;3.上海市食品藥品檢驗所,上海 201203)

疼痛(pain)是由實際的或潛在的組織損傷所引起的不愉快感覺[1],也是一種預警機制,防止機體遭受壓迫或進一步損傷,是當今困擾人類健康的嚴重問題之一。疼痛研究已經(jīng)成為當前神經(jīng)科學研究的熱點問題。

目前,臨床上對多種急慢性疼痛多采取西藥治療為主。其中一類為阿片類鎮(zhèn)痛藥,如哌替啶、嗎啡、可待因等,另一類為非阿片類鎮(zhèn)痛藥,如復方阿司匹林、吲哚美辛、布洛芬等。這兩類鎮(zhèn)痛藥雖然療效得到肯定,但長期使用會引起成癮性、消化性潰瘍等不良反應。因此,尋找副作用和依賴性小的止痛中藥已成為新趨勢。本文總結(jié)了近年來中藥鎮(zhèn)痛研究中常用的動物疼痛模型,進一步探討了疼痛相關(guān)物質(zhì)及其常用的測定方法,現(xiàn)綜述如下。

1 常見動物疼痛模型

1.1 物理刺激致痛模型

1.1.1 熱板法[2]熱板法是一個經(jīng)典的篩選鎮(zhèn)痛藥的實驗,其原理是將雌性小鼠放在(55±0.5)℃的熱板上,小鼠受熱刺激后可出現(xiàn)舔足反應,測定熱痛反應時間(痛閾);鎮(zhèn)痛藥可提高痛閾,延長熱痛反應時間。該模型對組織損傷最小,動物可反復利用,且簡便易行。如辛曉明等[3]采用熱板致痛法研究杜仲多糖對小鼠的鎮(zhèn)痛作用,結(jié)果表明其對熱板致痛有一定的抑制作用。

1.1.2 甩尾法 本法也屬于熱刺激致痛模型,是一種初級脊髓反射。具體方法是將動物適當固定后,令尾巴自然下垂,待動物安靜后,將尾巴浸于48℃熱水中,記錄從開始浸入到逃離水面的時間作為傷害性感受閾,以15 s為最長刺激時間上限。該方法的優(yōu)點是通過觀察藥物對不同水溫刺激致痛反應的影響,可初步評價藥物鎮(zhèn)痛作用的強度。如粘芙蓉等[4]用小鼠熱水甩尾法研究中藥穿山龍鎮(zhèn)痛作用,結(jié)果表明穿山龍水煎液對模型小鼠顯示出較好的鎮(zhèn)痛效應。

1.2 化學刺激致痛模型

1.2.1 扭體法 此模型是用某種化學刺激性物質(zhì)(如乙酸、酒石酸銻鉀、緩激肽等)注入小鼠腹腔后刺激臟層和壁層腹腔,致使小鼠出現(xiàn)扭體反應。該模型已成為常規(guī)藥物篩選方法,實驗中的作用強度與臨床鎮(zhèn)痛效果具有明顯的相關(guān)性。如劉少明等[5]采用小鼠腹腔注射乙酸造成疼痛模型,研究抗骨質(zhì)增生巴布劑(為新型中西藥復方制劑,方中主要含有生川烏、麝香等中藥的提取物及鹽酸利多卡因等藥物)的鎮(zhèn)痛作用。結(jié)果表明其能顯著降低小鼠扭體次數(shù),具有顯著的鎮(zhèn)痛作用。

1.2.2 炎癥(炎性反應)致痛模型 炎癥性疼痛是指由創(chuàng)傷、細菌或病毒感染以及外科手術(shù)引起的外周組織損傷導致炎癥時所引起的疼痛。研究中建立的經(jīng)典模型包括4%甲醛溶液(福爾馬林)致痛模型[6]、角叉菜膠炎癥模型[7]、佐劑關(guān)節(jié)炎模型[8]等,其中佐劑關(guān)節(jié)炎模型以福氏佐劑(Freund's adjuvant)作為致炎物質(zhì)。根據(jù)佐劑注射部位的不同可分為:多發(fā)性佐劑關(guān)節(jié)炎、單發(fā)性佐劑關(guān)節(jié)周圍炎和局限性單發(fā)性佐劑關(guān)節(jié)腔炎模型[9]。佐劑關(guān)節(jié)炎模型與人的類風濕性關(guān)節(jié)炎很相似,造模特異性高,假陽性率低,是慢性疼痛模型最為理想的模型之一。如譚煌英等[10]通過大鼠佐劑致炎造模,研究康萊特注射液(主要成分為薏苡仁油)鎮(zhèn)痛作用及其機制,結(jié)果表明該藥能顯著提高大鼠痛閾值,具有鎮(zhèn)痛作用。

1.3 神經(jīng)系統(tǒng)損害引起的疼痛 神經(jīng)病理性疼痛是外傷或疾患導致的外周神經(jīng)、脊髓背根、脊髓或腦內(nèi)某些區(qū)域的病損所致的疼痛。大多數(shù)神經(jīng)病理性疼痛的動物模型是人為地在動物的感覺傳導通道上制造損傷造成的。損傷的部位可包括外周神經(jīng)干、脊神經(jīng)、背根及脊髓[9]。神經(jīng)病理性疼痛模型可分為中樞性和外周性兩大類。如杜蘭芳等[11]采用外周神經(jīng)損傷和炎癥所致的大鼠慢性背根節(jié)壓迫神經(jīng)病痛模型,研究延胡索乙素(l-THP)對大鼠外周的鎮(zhèn)痛作用。結(jié)果表明,延胡索乙素可抑制慢性壓迫背根節(jié)神經(jīng)元異位自發(fā)放電,并且具有劑量依賴性,這一結(jié)果提示延胡索乙素抑制自發(fā)放電可能是延胡索抑制周圍神經(jīng)系統(tǒng)疼痛的機制之一。

2 中藥鎮(zhèn)痛相關(guān)物質(zhì)及其測定

中醫(yī)理論認為疼痛主要受氣、血、寒、熱等因素的影響[12],并隨著機體內(nèi)外環(huán)境的變化而變化。因此,研究中藥鎮(zhèn)痛作用機制是以中醫(yī)藥理論結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學方法進行研究探索的。目前,越來越多的中藥鎮(zhèn)痛研究采用先進的分析技術(shù)對疼痛相關(guān)物質(zhì),如與疼痛發(fā)生機制關(guān)系較為密切的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)、與神經(jīng)通路密切相關(guān)的即刻早期基因(c-fos),以及與外周、中樞不同水平的痛覺調(diào)節(jié)中起重要作用的一氧化氮等,進行檢測分析。所采用的手段包括色譜法、計算機分析技術(shù)、免疫組化和原位雜交法等(見表1)。

表1 疼痛相關(guān)物質(zhì)的測定Table 1 Determination of pain-related substances

2.1 單胺類神經(jīng)遞質(zhì) 單胺類神經(jīng)遞質(zhì)是一類調(diào)節(jié)機體生理活動的重要物質(zhì),包括去甲腎上腺素(NE)、腎上腺素、多巴胺(DA)、5-羥色胺(5-H T)等物質(zhì)。這些物質(zhì)在組織中的含量變化是反映神經(jīng)遞質(zhì)生物合成、釋放、攝取、失活等過程的生化指標[19]。它們既是神經(jīng)遞質(zhì),又能直接致痛,在疼痛過程中參與了致痛和鎮(zhèn)痛兩方面的作用。單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的檢測方法主要以HPLC-電化學法為主。此外,化學熒光法也是經(jīng)典而靈敏的檢測手段。已有文獻報道在甲醛致痛模型、乙酸疼痛模型,以及福氏佐劑致痛模型中測定單胺類神經(jīng)遞質(zhì)。

陳敏敏等[13]用HPLC-電化學法測定大鼠腦內(nèi)和血液中NE、5-H T、DA的含量,發(fā)現(xiàn)癌痛平可以降低甲醛致痛模型大鼠5-HT、DA、NE水平,推測其鎮(zhèn)痛作用機制可能與其影響NE、5-H T、DA含量有關(guān)。

2.2 一氧化氮(NO) NO是迄今為止在體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的第一個氣體信息分子,已成為生物學領域研究的熱點和前沿之一。NO作為一種神經(jīng)遞質(zhì)和信息傳遞分子,在外周、中樞以及脊髓不同水平的痛覺調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)源性NO水平的降低表現(xiàn)出一定的鎮(zhèn)痛效應;而在外周痛覺的調(diào)控中,認為抑制NO的合成可產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用[20]。文獻報道多通過建立甲醛致痛模型、福氏完全佐劑致痛模型及乙酸致痛模型,采用硝酸還原酶法檢測模型動物血清中NO,進行藥物鎮(zhèn)痛研究。

袁曉琴等[14]用硝酸還原酶法測定乙酸致痛小鼠NO含量,結(jié)果表明細辛乙酸乙酯提取物可顯著降低模型小鼠腦組織和血清中NO的含量,提示細辛的鎮(zhèn)痛與降低NO含量有關(guān)。

2.3 c-fos原癌基因表達 c-f os原癌基因是一種即刻早期基因,耦聯(lián)細胞外信息與細胞內(nèi)靶基因的轉(zhuǎn)錄,被稱為核內(nèi)“第三信使(third messenger)”。大量研究表明,c-fos基因參與細胞的正常生長、分化過程,調(diào)節(jié)細胞內(nèi)信息的傳遞過程,而且其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的表達與痛覺調(diào)控密切相關(guān)[21]。c-fos作為傷害性刺激的標志物,研究其與痛覺調(diào)控的關(guān)系有助于解決痛覺的形成及調(diào)控機制、針刺鎮(zhèn)痛原理,以及評價藥物鎮(zhèn)痛效能等難題。研究中大多建立甲醛疼痛模型,采用免疫組化染色法觀察c-fos基因表達。

陳榮明等[15]建立兩種致炎疼痛模型(甲醛、胰蛋白酶),觀察復方南星止痛膏對兩種模型大鼠足跖腫脹壓痛的影響及脊髓中 c-f os的表達。結(jié)果表明,復方南星止痛膏能減少模型大鼠c-f os陽性神經(jīng)元在脊髓背角淺層內(nèi)的表達,從而阻斷痛覺信息傳導通路,這可能是其發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用的機制之一。

2.4 谷氨酸 機體內(nèi)谷氨酸是由谷氨酰胺脫氨基或經(jīng)三羧酸循環(huán)產(chǎn)生的,它是興奮性神經(jīng)遞質(zhì)中最重要的一種興奮性氨基酸,在學習、記憶等生理過程和中樞疼痛感覺傳導方面起關(guān)鍵性作用。以谷氨酸為媒介的神經(jīng)沖動傳遞,誘發(fā)痛覺中樞產(chǎn)生高度興奮性是慢性疼痛形成的重要基礎[22]。檢測谷氨酸常用的方法包括HPLC法和比色法。

彭媛等[16]研究復方銀杏膠囊的鎮(zhèn)痛作用及其機制,采用比色法測定乙酸疼痛模型小鼠腦組織中谷氨酸的含量。結(jié)果表明,復方銀杏膠囊具有良好的鎮(zhèn)痛效應,其鎮(zhèn)痛作用可能與抑制腦組織中谷氨酸的釋放及鈣離子內(nèi)流有關(guān)。

2.5 降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene related peptide,CGRP) CGRP是一種含有37個氨基酸的神經(jīng)肽,廣泛分布于人和哺乳動物的中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)感覺神經(jīng)C-纖維末梢及組織器官中。有研究表明,痛覺過敏的形成與脊髓傷害性信息傳遞通路中 CGRP的釋放及其受體的激活有關(guān)[23]。CGRP的檢測以放射免疫分析法為主。

許國敏等[17]研究紅毛五加總苷灌胃對大鼠體內(nèi)疼痛介質(zhì)的影響,分別采用雙縮脲法和放射免疫法測定甲醛致痛模型大鼠血清及腦組織的NO和CGRP的變化。結(jié)果推測紅毛五加總苷的鎮(zhèn)痛作用可能不影響體內(nèi)CGRP水平,而與NO變化有關(guān)。

2.6 P物質(zhì)(substance P) P物質(zhì)是一種神經(jīng)肽,廣泛分布于中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng),在各種組織中呈現(xiàn)出多種生物效應。脊髓P物質(zhì)既可傳遞痛覺信息又有鎮(zhèn)痛作用,在脊髓水平參與痛覺的調(diào)控[24]。免疫組化法是P物質(zhì)的主要檢測方法。

楊明會等[18]觀察天元克痛方對甲醛疼痛模型大鼠痛反應的影響,采用免疫組化法測定大鼠脊髓背角P物質(zhì)含量。結(jié)果表明,天元克痛方能減少脊髓背角神經(jīng)元對傳入的傷害性刺激的反應,可能是其發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用的途徑之一。

3 小結(jié)和展望

目前,止痛中藥已成為現(xiàn)代藥物研究的熱點,中藥鎮(zhèn)痛研究中建立的動物疼痛模型能在不同程度上模擬人類各種疼痛的特點。在實際應用中,實驗者需針對研究目的去選擇或建立實用的疼痛模型。當然,動物疼痛模型的可復制性以及可靠性也還有待進一步完善。此外,目前模型的建立多采用單純外界傷害性刺激的方法,尚不能全面反映疾病內(nèi)在的實際情況,今后如能根據(jù)中醫(yī)對疼痛“不通則痛”病理機制的認識,建立符合中醫(yī)理論的中醫(yī)“證候”疼痛模型,將有利于深入揭示中藥鎮(zhèn)痛機制。

中醫(yī)藥理論對痛癥的病因病機以及治療均積累了豐富的經(jīng)驗,但由于疼痛產(chǎn)生的復雜性和中藥成分的復雜性,使得明確中藥鎮(zhèn)痛的作用機制還需要更加深入的探索。不過,隨著科技進步與創(chuàng)新,以及中藥現(xiàn)代化的發(fā)展,高效、安全的止痛藥研究一定會取得重大突破。

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