在線固相萃取-HPLC法測定比格爾犬血漿中丹參素的含量

王 麗,崔曉如,竇穎輝,聞 俊,杭太俊,范國榮*

(1.中國藥科大學(xué)藥學(xué)院藥物分析學(xué)教研室,南京 210009;2.第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥物分析學(xué)教研室,上海 200433)

丹參素(danshensu)又名D(+)-β-(3,4-二羥基苯基)-乳酸,是從唇形科植物丹參(Salvia miltiorrhiza Bge.)的根中提取分離的一種酚性芳香酸類化合物,是丹參的主要有效成分之一,具有保護(hù)心肌、抗血栓、抗炎、抗腫瘤等多種藥理活性[1]。近年來,中藥的藥動學(xué)研究已經(jīng)成為藥學(xué)研究的一個熱點,目前已有多篇以丹參素作為指標(biāo)成分的藥動學(xué)研究,不過這些文獻(xiàn)中多采用 HPLC[2]、HPLC/MS/MS[3]、在線固相萃取-HPLC法[4]、在線固相萃取-HPLC/MS/MS法[5]、膠束毛細(xì)管電泳法[6]和熒光光譜法[7]等方法,上述方法中樣品前處理較為復(fù)雜耗時,分析時間較長或檢測限較高,不適于大量生物樣品的分析。本研究在文獻(xiàn)方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行了優(yōu)化,建立了一種簡便、快速的新型在線固相萃取-HPLC法測定犬血漿中丹參素的濃度。

1 儀器、試藥和動物

島津超高效液相色譜儀:LC-20AD型泵,SIL-20A型自動進(jìn)樣器,CTO-20AC型柱溫箱,SPD-20A型紫外可見檢測器,DGU-20A3型脫氣機(jī),LV-306R型自動高壓切換閥及LC-solution色譜工作站(日本島津公司)。XW-80A型渦旋混合器(上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠),Thermo CR3i冷凍離心機(jī)(美國熱電公司)。HA-202M電子天平(日本A&D公司)。丹參素對照品(含量103%,批號:20081103-2-1)由第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院新藥研究中心提供;內(nèi)標(biāo)對羥基苯甲酸對照品(含量99%,批號:H0207)購自梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司。氯化鈉注射液購自上海百特醫(yī)療用品有限公司,乙腈為色譜純,其余試劑均為分析純。比格爾犬6條,雌雄各半,犬齡6～8個月,體重9～10 kg,由上海新岡實驗動物場提供,實驗動物合格證號:SCXK(滬)2007-0009。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件 富集柱 Lichrospher C18柱(37 mm ×4.6 mm,25 μ m),分析柱 Ultimate XBC18柱 (50 mm ×4.6 mm,5 μ m);富集流動相:乙腈-10 mmol/L NaH2PO4(5∶95),流速 2 ml/min;分析流動相:乙腈-10 mmol/L NaH2PO4(11∶89),流速0.8 ml/min;切換時間0.2 min,切回時間3.0 min,分析時間 5 min;檢測波長 285 nm;進(jìn)樣量 100 μ l。

2.2 溶液配制 (1)丹參素標(biāo)準(zhǔn)溶液 精密稱取丹參素對照品10 mg,置于10 ml棕色量瓶中,用甲醇溶解并定容,制成濃度為1 mg/ml的丹參素對照品貯備液。以40%甲醇稀釋該貯備液獲得濃度依次為0.20、0.50、1.00、2.00、5.00、10.00、20.00 μ g/ml的丹參素系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液,4℃冰箱中避光保存?zhèn)溆谩?2)內(nèi)標(biāo)工作溶液 精密稱取對羥基苯甲酸對照品10 mg,置于10 ml棕色量瓶中,用甲醇溶解并定容,制成濃度為1 mg/ml的內(nèi)標(biāo)貯備液。同樣以40%甲醇稀釋得1 μ g/ml的內(nèi)標(biāo)工作溶液,4℃冰箱中避光保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 在線固相萃取過程 在線固相萃取系統(tǒng)示意圖見圖1[8]。在線固相萃取過程主要是通過一個切換閥來實現(xiàn)的。當(dāng)切換閥在1號位時,樣品先進(jìn)入富集柱,經(jīng)富集流動相沖洗,使血漿中的干擾大分子和其他水溶性雜質(zhì)被沖掉,而被測物保留在柱子上。轉(zhuǎn)動切換閥至0號位,此時富集柱和分析柱成串聯(lián)狀態(tài),分析流動相把樣品從富集柱上反沖進(jìn)入分析柱,進(jìn)行分離測定。最后切回切換閥至1號位,分析流動相繼續(xù)對被測物進(jìn)行分析,富集流動相沖洗并平衡富集柱,等待下次進(jìn)樣。

2.4 血漿樣品預(yù)處理 取犬血漿樣品0.1 ml,加入內(nèi)標(biāo)工作溶液 10 μ l,渦旋混勻,加入 6%高氯酸溶液80 μ l,渦旋混合3 min,2.125 5×104×g離心10 min,取上清液100 μ l進(jìn)樣分析。

圖1 在線固相萃取系統(tǒng)示意圖[8]Figure 1 Schematic diagram of the on-line SPE system using a six-port switching valve(step 1,valve 1;step 2,valve0;step 3,valve 1)

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍 取比格爾犬空白血漿90 μ l,共7份,分別加入丹參素系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液10 μ l,制得相當(dāng)于丹參素濃度分別為 20、50、100、200、500、1000、2000 ng/ml標(biāo)準(zhǔn)含藥血漿樣品。按2.4項下操作,以丹參素濃度(c)為橫坐標(biāo),丹參素與內(nèi)標(biāo)峰面積比值(Y)為縱坐標(biāo),用最小二乘法進(jìn)行加權(quán)線性回歸,得回歸方程為Y=6.120×10-3c+6.907×10-3,r=0.999 6(n=7)。在20～2000 ng/ml濃度范圍內(nèi)血漿藥物濃度與峰面積比值線性關(guān)系良好。定量下限為20 ng/ml。

2.6 方法專屬性 以2.1項下色譜條件測得空白血漿、空白血漿標(biāo)準(zhǔn)添加丹參素和對羥基苯甲酸及給藥后血漿樣品的色譜圖見圖2。由圖2可見,丹參素和對羥基苯甲酸的保留時間分別約為2.5、4.3 min,內(nèi)源性物質(zhì)均不干擾丹參素和對羥基苯甲酸的色譜分離。

2.7 精密度及相對回收率實驗 取空白血漿15份分為3組,分別制備含50、200和 1 600 ng/ml 3種濃度的含藥血漿樣品,各5份。按2.4項下方法處理后1 d內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣,計算得日內(nèi) RSD分別為5.82%、2.40%、2.45%(n=5);連續(xù)測定3d,計算得日間 RSD分別為 6.35%、2.37%、6.06%(n=3)。3種濃度的丹參素含藥血漿樣品的相對回收率分別為(100.07±6.35)%、(106.86±2.54)%、(105.90±6.42)%(n=15)。

2.8 絕對回收率實驗 同上配制低、中、高濃度的含藥血漿樣品,按2.4項下方法處理并測定,測得的丹參素峰面積與等濃度丹參素溶液直接進(jìn)樣所得峰面積作比,得3種濃度血漿樣品的絕對回收率分別為80.05%、80.21%和84.89%(n=5)。

圖2 比格爾犬血漿中丹參素的HPLC譜圖Figure 2 HPLC photograms of danshensu in beagle dog plasma

2.9 穩(wěn)定性實驗 同上配制50、1 600 ng/ml的含藥血漿樣品,按2.4項下方法處理后分別進(jìn)行穩(wěn)定性實驗。分別考察血漿樣品在室溫放置2 h、進(jìn)樣器放置10 h、凍融3次和-20℃冷凍放置20 d的穩(wěn)定性。結(jié)果見表1。結(jié)果表明丹參素血漿樣品在上述條件下穩(wěn)定。

表1 丹參素血漿樣品穩(wěn)定性考察結(jié)果T able 1 Stability test results of danshensu in beagle dogplasma

2.10 稀釋效應(yīng)實驗 靜脈給藥時部分血漿樣品中藥物濃度較高,部分犬血漿樣品需要稀釋,因此要考察丹參素血漿樣品的稀釋效應(yīng)。由于血漿樣品直接稀釋到相應(yīng)濃度會引起較大的操作誤差,本實驗以1/2、1/5為基數(shù)對血漿樣品做相應(yīng)的稀釋。配制血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品和血漿質(zhì)量控制樣品,并配制稀釋至1/2、1/5、1/10、1/100后的中濃度和高濃度血漿質(zhì)量控制樣品各5份,按2.4項下方法處理后分別進(jìn)樣,計算得血漿樣品經(jīng)過稀釋后,其相對偏差值均＜6%,符合生物樣品分析測定要求,說明高濃度血漿樣品經(jīng)稀釋后測定結(jié)果不影響其實際血藥濃度。

2.11 比格爾犬體內(nèi)血藥濃度測定 健康成年比格爾犬6只,雌雄各半,依次稱重,按10 mg/kg的劑量靜脈注射丹參素氯化鈉注射液,分別于給藥前及給藥后0、2、5、10、20 、40 min,以及 1、1.5 、2、3、4、6、8、12 h在比格爾犬一側(cè)后肢靜脈取血2 ml,置肝素鈉抗凝離心管中,離心(4.555×103×g)10 min,分取上層血漿,-80℃避光保存。取血漿樣品,按2.4項下方法處理并測定,按標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算各時間點血漿藥物濃度,結(jié)果見圖3。

圖3 比格爾犬單劑量靜注10 mg/kg丹參素后的藥-時曲線Figure3Mean drug plasma concentration-time curve of danshensu after single intravenous dose of 10 mg/kg in beagle dogs;n=6

3 討 論

3.1 富集流動相的選擇 富集流動相常以水溶性溶液為主,以除去部分蛋白質(zhì)及其他內(nèi)源性水溶性雜質(zhì)并使被測組分保留在富集柱上。但由于犬血漿樣品中干擾物質(zhì)較多,故在富集流動相中加入低比例乙腈,更有利于除去血漿中的干擾物質(zhì)。

3.2 預(yù)處理方法的選擇 在線固相萃取技術(shù)允許血漿樣品直接進(jìn)樣,但血漿樣品內(nèi)大量蛋白質(zhì)及內(nèi)源性雜質(zhì)會使柱子阻塞、柱壓升高,影響柱子的柱效并減少柱子的使用壽命。因此在實際操作過程中,通常用沉淀法除去血漿樣品中的部分蛋白質(zhì)后再進(jìn)樣分析,既提高分離效果,又延長柱子使用壽命。

3.3 切換時間和切回時間的選擇 在線固相萃取時切換時間較短,富集流動相的流速較大,以有利于在短時間內(nèi)沖掉大部分蛋白質(zhì)并使被測物保留在富集柱上。選擇合適的切回時間,有利于被測物完全轉(zhuǎn)移至分析柱并有充足的時間平衡富集柱。因此選擇0.2 min作為切換時間,3.0 min作為切回時間,整個分析時間5 min。

3.4 富集柱的選擇 富集柱的長度應(yīng)適宜,防止高流速時兩根柱子串聯(lián)造成極高的柱壓;富集柱填料的粒徑應(yīng)適宜,既利于沖掉大分子蛋白質(zhì),又利于保留被測物。因此選擇了自制 Lichrospher C18柱(37 mm×4.6 mm,25 μ m)作為富集柱。

本研究采用在線固相萃取-HPLC法測定比格爾犬血漿樣品中丹參素的濃度,使樣品的純化、富集與分析同步進(jìn)行,操作簡單,提取效率高,分析時間短,適于大量生物樣品的分析。

[1] 李艷杰,孫玉華.丹參素藥理作用研究進(jìn)展[J].延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)學(xué)報,2006,29(1):73-74.Li YanJie,Sun YuHua.Advances in research on pharmacological effects of danshensu[J].J Med Sci Yanbian Univ,2006,29(1):73-74.Chinese.

[2] Li Xiao Li,Li Xiao Rong,Wang LiJuan,et al.Simultaneous determination of danshensu,ferulic acid,cry ptotanshinone and tanshinoneⅡA in rabbit plasma by HPLC and their pharmacokinetic application in danxiongfang[J].J Pharm Biomed Anal,2007,44(5):1106-1112.

[3] Liu Yun,Li XiaoRong,Li YuHang,et al.Simultaneous determination of danshensu,rosmarinic acid,cryptotanshinone,tanshinoneⅡA,tanshinoneⅠand dihydrotanshinoneⅠ by liquid chromatographic-mass spectrometry and the application to pharmacokinetics in rats[J].J Pharm Biomed Anal,2010,53(3):698-704.

[4] 趙新峰,祝忠民,劉愛芳,等.柱切換法在復(fù)方丹參滴丸中丹參素藥代動力學(xué)研究中的應(yīng)用[J].中成藥,2004,26(6):490-492.Zhao XinFeng,Zhu ZhongMin,Liu AiFang,et al.Qualitative and quantitative analysis of Compound Danshen Dripping Pills by CS-HPLC[J].Chin T radit Pat M ed,2004,26(6):490-492.Chinese with abstract in English.

[5] Pei WeiJing,Zhao XinFeng,Zhu ZhongMin,et al.Study of the determination and pharmacokinetics of compound Danshen dripping pills in human serum by column switching liquid chromatography electrospray ion trap mass spectrometry[J].J Chromatogr B Analyt T echnol Biomed Life Sci,2004,809(2):237-242.

[6] 楊 燕,楊 榮,衛(wèi)引茂,等.膠束毛細(xì)管電泳法測定家兔體內(nèi)的丹參素及藥代動力學(xué)和組織分布[J].藥物分析雜志,2008,28(3):362-366.Yang Yan,Yang Rong,Wei YinM ao,et al.MEKC determination of pharmacokinetic and tissue distribution study of Danshensu in rabbits[J].Chin J Pharm Anal,2008,28(3):362-366.Chinese with abstract in English.

[7] 何懷冰,王 蓓,陳 沄,等.熒光光譜法測定家兔中丹參素血濃度及其藥物動力學(xué)參數(shù)[J].上海第一醫(yī)學(xué)院學(xué)報,1983,10(4):295-300.He HuaiBing,Wang Bei,Chen Yun,et al.Spectrofluorometric determination of rabbit plasma level and pharmacokinetic parameters of“Dan-shen-su”[J].Acta Acad Med Primae Shanghai,1983,10(4):295-300.Chinese with abstract in English.

[8] Xie Rui,Wen Jun,Wei Hua,et al.Hig h-throughput determination of faropenem in human plasma and urine by on-line solid-phase extraction coupled to high-performance liquid chromatography with UV detection and its application to the pharmacokinetic study[J].J Pharm Biomed Anal,2010,52(1):114-121.