激活素A及卵泡抑素基因在糖尿病大鼠腎臟表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究*

任小軍 柳 剛 關(guān)廣聚

1 山西省人民醫(yī)院腎內(nèi)科,山西省太原市 030012; 2 山東大學(xué)第二醫(yī)院腎內(nèi)科

糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)過(guò)去一直被認(rèn)為是一種腎小球疾病,而新近的研究表明,小管損傷和進(jìn)行性間質(zhì)纖維化與DN的預(yù)后關(guān)系更為密切[1]。DN小管間質(zhì)病變的核心是細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)在損傷區(qū)的過(guò)量堆積[2]。多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子參與了ECM的生成和降解,其中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-beta,TGF-β)超家族成員發(fā)揮了重要作用。根據(jù)結(jié)構(gòu)和分子生物學(xué)差異,TGF-β超家族可以細(xì)分為三個(gè)主要家族:TGF-β、骨形成蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)和激活素(activin,ACT)[3]。TGF-β是公認(rèn)的最強(qiáng)的促纖維化因子,BMP7可對(duì)抗TGF-β的作用。而ACT是否參與了DN小管間質(zhì)纖維化,目前還未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。ACT是由兩個(gè)β亞單位借二硫鍵構(gòu)成的二聚體蛋白,按照β亞基構(gòu)成的不同,ACT分為三種形式:ACT-A(βAβA)、ACT-B(βBβB)、ACT-AB(βAβB),目前研究最多的是ACT-A[4]。卵泡抑素(follistatin,FS)是ACT的天然結(jié)合蛋白,二者共同構(gòu)成一個(gè)維持組織器官正常生長(zhǎng)和代謝的自動(dòng)平衡系統(tǒng)[5]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體內(nèi)鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的DM動(dòng)物模型,探討ACT-A及FS基因在糖尿病大鼠腎臟的表達(dá),從而為進(jìn)一步闡明DN的發(fā)病機(jī)制及臨床防治提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:清潔級(jí)雄性Wistar大鼠,6周齡,體重(200±20)g之間,由山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 主要試劑:STZ購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;尿白蛋白試劑盒購(gòu)自北京福瑞公司;反轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自日本Takara公司。

1.1.3 引物設(shè)計(jì):引物均由上海生物工程公司合成。見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物模型和分組:將雄性Wistar大鼠隨機(jī)分成糖尿病組(DM)和對(duì)照組(NC)。DM 組在禁食12h后一次性腹腔注射STZ 60mg/kg(臨用前溶于0.1mo1/L檸檬酸緩沖液,1∶50稀釋,pH4.4),NC組給予相同劑量的溶媒。給藥72h后尾靜脈采血測(cè)隨機(jī)血糖(BS)＞16.7mmo1/L為糖尿病大鼠。所有大鼠標(biāo)準(zhǔn)飼料飼養(yǎng),自由飲水。各組分別于造模后4、8、12、16周處死大鼠 6只。處死前 1d,大鼠稱重后單只置于代謝籠中,準(zhǔn)確收集24h尿液。腹主動(dòng)脈取血后分離左腎,置液氮待做PCR檢測(cè)。

1.2.2 生化指標(biāo):尿白蛋白排泄率(AER)檢測(cè)采用放免法。腎臟肥大指數(shù)用左腎重/體重(KW/BW)表示。BS、血肌酐(Scr)及尿肌酐(Ucr)用 HITACH-7150自動(dòng)生化分析儀檢測(cè),肌酐清除率(Ccr)按公式:Ucr×每分鐘尿量(ml)/Scr計(jì)算,并以體重校正。

1.2.3 real time-PCR檢測(cè):取全腎組織約50mg左右,按照經(jīng)典方法用 Trizol試劑、氯仿和異丙醇進(jìn)行抽提mRNA。檢測(cè)純度,按反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,引物由上海生工合成。采用ABI PRISM 7000 HT進(jìn)行real-time PCR,獲得Ct值。根據(jù)公式:Folds=2-ΔΔCt進(jìn)行各組間比較分析。

2 結(jié)果

2.1 一般生化指標(biāo)的變化 DM組大鼠腹腔注射STZ后,BG 明顯升高,呈消瘦、多飲、多食、多尿、自主活動(dòng)減少等典型的糖尿病癥狀。實(shí)驗(yàn)第8周,NC組大鼠體重明顯增加,DM組大鼠體重增加緩慢,DM組大鼠腎臟肥大指數(shù)(KW/BW)與NC組相比明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。與NC組相比,DM組大鼠AER及Ccr從第8周開(kāi)始呈逐漸增高趨勢(shì),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);DM組內(nèi)16周末與8周末比較亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)差別(P＜0.01)。見(jiàn)表1。

表2 各組大鼠BS、AER、KW/BW 及Ccr的變化( ±s)

表2 各組大鼠BS、AER、KW/BW 及Ccr的變化( ±s)

注:與NC組同一時(shí)間點(diǎn)比較,*P＜0.01;DM組內(nèi)16周末與8周末比較,#P＜0.01。

組別 周數(shù) BS(mmol?L-1) AER(mg?g-1) KW/BW(mg?g-1) Ccr(ml?min-1?kg-1)NC 4 5.59±0.16 0.26±0.02 4.85±0.20 2.60±0.23 DM 26.26±1.58* 0.30±0.03 5.30±0.28 2.95±0.21 NC 8 5.71±0.24 0.28±0.03 4.72±0.28 2.67±0.22 DM 27.22±2.47* 3.67±0.25* 6.84±0.44* 5.12±0.34*NC 12 5.68±0.30 0.30±0.02 4.68±0.34 2.63±0.26 DM 27.97±2.25* 6.25±0.49* 7.75±0.85* 6.31±0.52*NC 16 5.74±0.30 0.31±0.02 4.74±0.33 2.80±0.34 DM 28.19±1.62* 7.36±0.57*# 8.44±0.67*# 6.62±0.56*#

2.2 腎組織ACTβA及FS mRNA表達(dá)的變化ACTβA mRNA在NC組只有極微量表達(dá),而DM組大鼠腎組織ACTβA mRNA從第4周起即明顯增加(NC組的3.3倍),于12周時(shí)達(dá)峰值(NC組的7.7倍),16周時(shí)表達(dá)量略有下降,但仍明顯高于NC組(P＜0.01)。與 ACTβA相反,FS mRNA 在NC組各時(shí)間點(diǎn)大鼠腎組織大量表達(dá),而在DM組其表達(dá)量呈逐漸下降趨勢(shì),第4周下降了32.5%,第12周時(shí)下降了52.9%,第16周時(shí)只能檢測(cè)到基礎(chǔ)量表達(dá)。見(jiàn)圖1。

3 討論

ACT最早在性腺發(fā)現(xiàn)的糖蛋白激素,因特異性促進(jìn)垂體細(xì)胞合成及分泌卵泡刺激素(FSH)而得名,后來(lái)發(fā)現(xiàn)它具有多種生物功能,屬于TGF-β超家族成員,其作用不僅局限于性腺,而且在組織細(xì)胞生長(zhǎng)分化、骨形成、胚胎發(fā)育、免疫調(diào)節(jié)、組織損傷修復(fù)及炎癥反應(yīng)過(guò)程中均發(fā)揮了重要作用。目前研究最多的是ACT-A[3]。FS也是由性腺分離的糖蛋白激素,可抑制垂體細(xì)胞分泌FSH,還可與ACT-A高度親和力的結(jié)合,阻斷ACT-A的生物學(xué)效應(yīng)[6]。類似于TGF-β,ACT-A的適度表達(dá)有助于組織損傷修復(fù),但其過(guò)度表達(dá)可促進(jìn)組織纖維化的形成。ACT-A表達(dá)與腎臟關(guān)系密切。胚胎腎臟發(fā)育過(guò)程中,輸尿管芽可以檢測(cè)到ACT-A。外源性ACT-A可以縮小胚胎腎發(fā)育體積,減少腎單位數(shù)量[7]。正常成年大鼠腎小管ACT-A幾乎檢測(cè)不到,而FS則大量表達(dá)。在腎缺血時(shí),外髓腎小管上皮ACT-A分泌增加,而FS則明顯下降。將rh-ACT-A注入腎缺血大鼠體內(nèi),可促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞凋亡,抑制腎小管上皮細(xì)胞增殖,加重小管損傷[8]。ACT-A在DN小管間質(zhì)病變中是否發(fā)揮一定的作用,目前還未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

圖1 real-time PCR檢測(cè)ACT A和FN的基因表達(dá)

本研究表明,從實(shí)驗(yàn)第8周開(kāi)始,DM組大鼠AER和Ccr表達(dá)增加并于16周時(shí)達(dá)峰值,符合DN早期功能改變。本研究發(fā)現(xiàn),在STZ誘導(dǎo)的DM大鼠,ACT-A基因在實(shí)驗(yàn)第4周,腎臟功能損傷缺如時(shí),在腎臟表達(dá)即開(kāi)始上調(diào),并于12周時(shí)達(dá)峰值;與之相反,ACT-A的拮抗劑FS,在NC組大鼠腎臟大量表達(dá),而在DM組,其表達(dá)量逐漸下降,呈時(shí)間依賴性。這一結(jié)果提示ACT-A/FS表達(dá)失衡在糖尿病大鼠腎臟損傷的進(jìn)行性發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。但ACT-A參與糖尿病腎損傷的具體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制及外源性補(bǔ)充FS是否可延緩糖尿病腎損傷有待進(jìn)一步體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

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