互穿網(wǎng)絡(luò)改性的蛋白質(zhì)印跡海藻酸鈣微球的制備與表征

英曉光，張鳳菊，張立廣，成國(guó)祥

(1. 天津大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300072；2. 福州大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，福州 350108)

分子印跡技術(shù)已廣泛應(yīng)用于各種結(jié)構(gòu)和功能材料的制備和分離過(guò)程[1]．國(guó)內(nèi)較早的關(guān)于分子印跡聚合物及技術(shù)(MIP&T)的論述見(jiàn)于黃文強(qiáng)等[2]的綜述．制備球形聚合物微球的方法主要有分散聚合、沉淀聚合、多步溶脹懸浮聚合和表面模板聚合等[3]．隨著研究的深入，生物大分子印跡聚合物材料在眾多生物技術(shù)研究領(lǐng)域中發(fā)揮著更為復(fù)雜的功能[4]．以常規(guī)聚合方法制備蛋白質(zhì)印跡聚合物材料面臨諸多困難，因蛋白質(zhì)分子具有體積龐大、結(jié)構(gòu)復(fù)雜、可結(jié)合位點(diǎn)多以及容易變性失活等特性．水凝膠材料的疏松網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)以及溫和的凝膠化過(guò)程使之成為制備大分子印跡基材的首選．此外光引發(fā)聚合等溫和成型方法也是制備 MIP常用方案．將孔結(jié)構(gòu)引入分子印跡聚合物是針對(duì) MIP結(jié)構(gòu)調(diào)整和性能優(yōu)化的重要設(shè)計(jì)，為溶質(zhì)的擴(kuò)散提供了良好的空間，同時(shí)也是質(zhì)量交換的重要場(chǎng)所．多孔結(jié)構(gòu)的 MIP更加適合大分子特別是蛋白質(zhì)分子印跡聚合物的制備及應(yīng)用[1]．

海藻酸鈣凝膠具有凝膠條件溫和、凝膠化過(guò)程迅速等特點(diǎn)．牛血清白蛋白(BSA)印跡的多孔海藻酸鈣凝膠微球?qū)δ０宸肿泳哂刑禺愔亟Y(jié)合性能[5]．然而海藻酸鹽含水量高、機(jī)械強(qiáng)度低、抗溶脹性能差．交聯(lián)劑戊二醛與 β二羥基形成六元環(huán)的縮醛反應(yīng)可以完成糖苷鏈和脂肪鏈上羥基之間的交聯(lián)[6]，然而用戊二醛處理過(guò)的海藻酸鹽凝膠微球強(qiáng)度不足，干燥之后發(fā)生團(tuán)聚[7]．在海藻酸鹽凝膠體系中引入少量的第2種組分并進(jìn)行交聯(lián)，可以構(gòu)成互穿網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，如戊二醛交聯(lián)海藻酸鈉-羥乙基纖維素[8-9]以及戊二醛交聯(lián)海藻酸鈉-聚乙烯醇(PVA)共混膜等[10-11]．纖維素醚是天然高聚物纖維素的衍生物，具有較好的水溶性．筆者將研究少量不同種類(lèi)的纖維素醚在交聯(lián)劑戊二醛作用下，在海藻酸鈣基材中形成的互穿網(wǎng)絡(luò)(interpenetrateing networks，IPNs)對(duì)微球性質(zhì)的影響；進(jìn)而使用IPNs改性凝膠制備蛋白質(zhì)及乳液雙印跡微球，研究這種改性方法對(duì)該體系的重結(jié)合行為產(chǎn)生的影響．

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與材料

海藻酸鈉(Alginate，Alg，Mn＝35,000，Mw＝218,000)，化學(xué)純，北京市旭東化工廠(chǎng)生產(chǎn)；羥乙基纖維素(hydroxyl ethyl cellulose，HEC)HD30000、甲基纖維素(methyl cellulose，MC)55HD12000、羥丙基甲基纖維素(hydroxyl propyl methyl cellulose，HPMC)60HD20000，醫(yī)用級(jí)，山東赫達(dá)股份有限公司生產(chǎn)；牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)、卵白蛋白(Ovalbumin，OVA)，F(xiàn)luka Chemie Gmbh；戊二醛(glutaraldehyde)50%水溶液、三氯甲烷、正己烷，化學(xué)純，天津大學(xué)科威公司生產(chǎn)；Span80、Span85，化學(xué)純，中國(guó)醫(yī)藥公司北京采購(gòu)站提供；三羥甲基氨基甲烷[Tris，Tris(hydroxymethyl)aminomethane，C4H11NO3]，分析純，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所提供．

1.2 制備過(guò)程

1.2.1 纖維素醚溶液的配制

海藻酸鈉溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 3%)3份各 100,mL分別與7.5,mL MC(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%)、7.5,mL HEC(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%)和7.5,mL HPMC(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%)充分?jǐn)嚢柚粱旌暇鶆颍o置脫泡，得到各種纖維素醚質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%(干重)的均一黏稠混合溶液．

1.2.2 蛋白質(zhì)及乳液雙印跡改性微球的制備

配制20,μmol/L的BSA溶液18,mL，緩慢攪拌中加入0.06,g海藻酸鈉粉末，使其充分溶解；加入2,mL, 2%纖維素醚溶液，配制成3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))海藻酸鈉-0.2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))纖維素醚溶液．乳液模板的引入采用如下方法：在混合均勻的BSA-海藻酸鈉-纖維素醚溶液中加入1,g液體石蠟、0.1,g Span85、0.4,g Tween80，電磁攪拌1,h(400,r/min)，成為均一穩(wěn)定的乳液．

用反相懸浮交聯(lián)法[5,12]，將乳液制備成海藻酸鈣凝膠(Ca-Alginate，Ca-Alg)微球(microspheres，Ms)．具體方法如下：將乳液加入由三氯甲烷和正己烷組成的反相懸浮體系，待懸浮液滴粒徑穩(wěn)定后(約30,min)，逐滴加入2%CaCl2水溶液；在經(jīng)過(guò)約30,min，凝膠化過(guò)程完成后，從懸浮介質(zhì)中分離，洗凈待用．

將微球置于含有 3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))CaCl2和 5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))新制戊二醛微酸性溶液(pH＝5.85)中，于室溫下浸泡32,h，制得戊二醛交聯(lián)的甲基纖維素-海藻酸鈣凝膠(MC-Alg)、羥乙基纖維素-海藻酸鈣凝膠(HECAlg)和羥丙基甲基纖維素-海藻酸鈣凝膠(HPMCAlg)改性微球．使用梯度乙醇溶液及乙醚溶液將微球中的乳液模板移除，進(jìn)而在 150,mL,pH＝7.5、濃度為0.05,mol/L的Tris-HCl緩沖液中浸泡約48,h，期間定時(shí)更換緩沖液并測(cè)試其中蛋白質(zhì)濃度以確定洗脫進(jìn)程．待模板分子完全移除，即可得到 BSA及乳液雙印跡微球(dually imprinted microspheres，dIMs)．

1.3 性能測(cè)試

1.3.1 紅外光譜實(shí)驗(yàn)

將干燥的改性微球樣品研成粉末，利用紅外光譜儀(FTS3000)測(cè)定其紅外吸收譜圖．

1.3.2 溶脹性能實(shí)驗(yàn)

將各種改性微球烘干脫水后，置于生理鹽水(NaCl 0.9%)中溶脹，每隔一定時(shí)間取出微球稱(chēng)重，令微球初始干重為 m0(單位：g)，溶脹后的質(zhì)量為 m(單位：g)，則溶脹比 y(無(wú)量綱)的計(jì)算式為y =．繪制時(shí)間-溶脹度曲線(xiàn)．

1.3.3 機(jī)械強(qiáng)度實(shí)驗(yàn)

在等量 30,mL的 NaCl溶液(0.9%)中加入 5塊沸石，并分別放入相同數(shù)量的改性微球，置于振蕩培養(yǎng)箱(HZQ-F)中恒溫(25,℃)等頻(150,r/min)振蕩 25 h；之后將微球及破損物取出，置于光學(xué)顯微鏡(Axiovert,25)下觀察其破碎情況并與完整形態(tài)比較．

1.3.4 印跡微球的重結(jié)合實(shí)驗(yàn)及印跡效率計(jì)算

精確稱(chēng)取洗脫蛋白質(zhì)模板的微球1.500,g浸泡于20,mL 20,μmol/L的BSA溶液中，并置于25,℃、轉(zhuǎn)速100,r/min的振蕩培養(yǎng)箱(HZQ-F)中，每隔一定時(shí)間以U-1800型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定上層清液濃度，濃度和重結(jié)合量Q(單位：g)之間的關(guān)系為

式中：C0是BSA初始質(zhì)量濃度，mg/mL；Ct是BSA不同時(shí)刻的質(zhì)量濃度，mg/mL；V是 BSA 溶液體積(20 mL)；W 是微球質(zhì)量(1.500,g)．根據(jù)下式可以計(jì)算出印跡效率(imprinting efficiency，IE)：

式中 Q0是 BSA分子在非印跡微球上的非特異性重結(jié)合量，g．

1.3.5 模板洗脫率的計(jì)算

由于戊二醛可能將蛋白質(zhì)交聯(lián)，導(dǎo)致模板難以洗脫，因此須計(jì)算洗脫的模板占使用模板總量的比例(或生成有效印跡的數(shù)量占總印跡數(shù)量的比例)．測(cè)定前 3次模板洗脫所用緩沖液體積及其中的蛋白質(zhì)濃度，計(jì)算洗脫模板的總量；與制備印跡所使用的蛋白質(zhì)模板總量對(duì)比，即可獲得模板洗脫率．

1.3.6 離子交換色譜表征

為了證實(shí)印跡微球在 2種模板分子溶液中重結(jié)合行為的差異性，即印跡選擇性，采用高效液相離子交換色譜法分析重結(jié)合前后溶液成分的變化．色譜柱規(guī)格為Φ2.1,mm×200,mm，填料為交聯(lián)羥丙基纖維素(SP-纖維素 HP)，采用自動(dòng)沉降法填柱；緩沖液為各種濃度的磷酸鈉溶液(0.02～0.6,mol/L)，以及磷酸二氫鉀-磷酸氫二鈉緩沖溶液；0.5,mol/L,NaCl溶液以及 0.5,mol/L,NaOH 溶液；流動(dòng)相最高流速為2,mL/min，最高柱壓為 570,psi(即 3.9,MPa，1標(biāo)準(zhǔn)大氣壓(atm)＝14.696磅/吋2(psi))；檢測(cè)器條件為230,nm、室溫下紫外檢測(cè)．

2 結(jié)果與討論

在互穿網(wǎng)絡(luò)改性的海藻酸鈣水凝膠微球的分子印跡及重結(jié)合實(shí)驗(yàn)中，共價(jià)交聯(lián)的纖維素醚的種類(lèi)及含量對(duì)微球的重結(jié)合行為將產(chǎn)生不同程度的影響．圖1所示為BSA及乳液印跡海藻酸鈣凝膠微球光學(xué)顯微形貌．

圖1 牛血清白蛋白及乳液印跡海藻酸鈣印跡微球Fig.1 BSA and emulsion imprinted Ca-Alg Ms

2.1 紅外光譜

纖維素醚和戊二醛形成互穿網(wǎng)絡(luò)，通過(guò)紅外光譜可以檢測(cè)到共價(jià)鍵的生成．紅外測(cè)試分別對(duì)未改性的海藻酸鈣凝膠(Ca-Alg)和3種纖維素交聯(lián)改性之后的海藻酸鈣凝膠(HEC-Alg、HPMC-Alg和MC-Alg)樣品進(jìn)行(如圖 2所示)．改性之后(b、c、d譜線(xiàn))3種凝膠的 C—O—R’CR—O—C 縮醛官能團(tuán)的吸收峰(1,031,cm-1)和—CO—羰基的吸收峰(1,610,cm-1)均比改性之前a強(qiáng)度增大，這是因?yàn)槲於┰诶w維素醚分子的羥基之間形成縮醛和半縮醛，從而導(dǎo)致這2種官能團(tuán)含量增加．

圖 2 不同種類(lèi)纖維素互穿網(wǎng)絡(luò)改性的海藻酸鈣凝膠紅外光譜Fig.2 FTIR of Ca-Alg hydrogel with IPNs of different kinds of cellulose

2.2 溶脹性能

圖3為微球溶脹過(guò)程中溶脹度隨時(shí)間的變化曲線(xiàn)，所有樣品在起初200,min內(nèi)的溶脹速率較快，而這以后HEC-Alg和HPMC-Alg凝膠微球的溶脹度變化很小，并于400,min左右達(dá)到平衡．對(duì)于未經(jīng)過(guò)與纖維素醚混合或未用戊二醛溶液處理過(guò)的樣品，整個(gè)溶脹過(guò)程的吸水量持續(xù)上升，直到微球破損．未改性的Ca-Alg凝膠微球的最終質(zhì)量約為初始值的10倍，而HEC-Alg改性微球溶脹后的質(zhì)量?jī)H為初始值的4倍．

圖3 不同海藻酸鈣凝膠微球的溶脹度曲線(xiàn)Fig.3 Swelling ratio-time curves of different Ca-Alg Ms

微球溶脹被抑制是戊二醛和纖維素醚共同作用的結(jié)果．纖維素醚和海藻酸鈣分子中的羥基形成氫鍵；戊二醛進(jìn)而與纖維素醚分子上其他羥基發(fā)生縮醛反應(yīng)，在凝膠中形成互穿網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，起到抑制溶脹的作用．纖維素醚單獨(dú)與海藻酸鹽凝膠復(fù)合僅僅依靠氫鍵的作用，而海藻酸鈣分子六元環(huán)上的羥基對(duì)縮醛反應(yīng)的活性很低，與戊二醛起縮醛反應(yīng)的量極少，都不能有效抑制溶脹．在光鏡下觀察 Ca-Alg凝膠微球和 HEC-Alg改性微球的形貌，可以比較出交聯(lián)對(duì)溶脹的抑制效果．Ca-Alg微球溶脹速率較高，且在接近溶脹平衡時(shí)出現(xiàn)破損；而 HEC-Alg改性微球溶脹速率較小，即使在溶脹末期也未出現(xiàn)破損情況．

2.3 機(jī)械強(qiáng)度

將相同條件下，Ca-Alg微球和 HEC-Alg改性微球在生理鹽水中進(jìn)行振蕩破損實(shí)驗(yàn)，并統(tǒng)計(jì)破損個(gè)數(shù)，結(jié)果列于表1．比較后發(fā)現(xiàn)未改性的Ca-Alg微球在振蕩 25,h后有較多數(shù)量的破損；而 HEC-Alg改性微球相對(duì)破損數(shù)量較少，保持了較好的球形和完整性．這是因?yàn)橛?HEC改性之后，互穿網(wǎng)絡(luò)中的共價(jià)交聯(lián)點(diǎn)和分子間作用使微球的機(jī)械強(qiáng)度提高，抵御碰撞破損的能力增強(qiáng)．

表1 海藻酸鈣和羥乙基纖維素互穿網(wǎng)絡(luò)改性海藻酸鈣微球的振蕩破損實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Oscillation test results of Ca-Alg Ms and Ms modified by IPNs

2.4 模板洗脫率

通過(guò)紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定 3次洗脫液中蛋白質(zhì)的含量，可以確定蛋白質(zhì)模板的洗脫率，如表 2所示．第 3次的洗脫液中幾乎檢測(cè)不到蛋白質(zhì)，可認(rèn)為模板已完全移除．模板的洗脫率(或印跡的生成率)可以用洗脫液中蛋白質(zhì)總量與制備過(guò)程中使用的模板質(zhì)量的比值表示．根據(jù)表 2，82.20%的蛋白質(zhì)模板被洗脫，其他的模板則被包埋在基材內(nèi)部．

表2 BSA分子印跡微球模板的洗脫率Tab.2 Eluting ratio of template in molecular imprinted Ms

2.5 雙印跡凝膠微球的重結(jié)合行為

2.5.1 振蕩體系下的重結(jié)合實(shí)驗(yàn)

圖 4所示為 25,℃、轉(zhuǎn)速 100,r/min的振蕩培養(yǎng)箱環(huán)境里，單位質(zhì)量的印跡微球在 BSA溶液中的重結(jié)合量隨時(shí)間的變化曲線(xiàn)．未改性的兩組微球?qū)VA 的最大重結(jié)合量(20.867，17.747)比兩組 HECAlg改性微球樣品高(13.493，11.480)．這可能是因?yàn)槔w維素的混入造成海藻酸鈣凝膠網(wǎng)絡(luò)致密，使蛋白質(zhì)分子滲入阻力增大；或是因?yàn)槔w維素分子占據(jù)、替換和遮蓋了海藻酸鈣網(wǎng)絡(luò)上印跡的有效位點(diǎn)，從而降低了微球?qū)Ψ肿拥慕Y(jié)合效率．

從印跡效率(IE)計(jì)算結(jié)果(見(jiàn)圖 5)也可得知，由于實(shí)驗(yàn)后期微球溶脹程度很大，印跡結(jié)構(gòu)變形，逐漸失去特異性重結(jié)合能力，原先的特異性重結(jié)合能力被非特異性重結(jié)合所取代．經(jīng)由 HEC改性的微球樣品，無(wú)論是否含有乳液孔穴，印跡效率最大值均高于各自未改性的空白對(duì)照組樣品．由計(jì)算可知，經(jīng)由HEC改性后，雙印跡和分子印跡微球最大印跡效率分別由1.889和1.794提高到1.922和1.820．

圖4 振蕩培養(yǎng)環(huán)境中的重結(jié)合量曲線(xiàn)Fig.4 Rebinding quantity in oscillation environment

圖5 振蕩培養(yǎng)環(huán)境中的印跡效率Fig.5 Imprinting efficiency in oscillation environment

2.5.2 靜置體系下的重結(jié)合實(shí)驗(yàn)

將Ca-Alg雙印跡微球及HEC-Alg雙印跡微球各自浸泡于20,mL 含有BSA,20,μmol/L、CaCl20.5%的溶液中，測(cè)量吸光度并計(jì)算重結(jié)合量隨時(shí)間的變化規(guī)律．由圖6可以看出經(jīng)由HEC交聯(lián)改性的微球最大重結(jié)合量明顯高于未改性微球，釋放速率低于未改性微球．同時(shí)通過(guò)計(jì)算發(fā)現(xiàn)，改性微球的印跡效率高于未改性微球(見(jiàn)圖7)；且經(jīng)HEC改性后，雙印跡微球最大印跡效率由2.19提高到2.70．在這次實(shí)驗(yàn)中改性微球具有比未改性微球更高的重結(jié)合量和印跡效率，與振蕩體系中得出的結(jié)論不一致，這種現(xiàn)象與微球重結(jié)合機(jī)理和2種實(shí)驗(yàn)體系不同有關(guān)．

微球的互穿網(wǎng)絡(luò)改性對(duì)重結(jié)合行為的影響可以歸結(jié)為擴(kuò)散因素和微環(huán)境改變兩方面．振蕩培養(yǎng)箱的機(jī)械運(yùn)動(dòng)促使擴(kuò)散速率加快；未經(jīng)改性的海藻酸鈣微球網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)松散、孔隙較大，而經(jīng)交聯(lián)改性的微球網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)緊密、孔隙較小，決定了前者的內(nèi)外擴(kuò)散速率要大于后者，微球內(nèi)部的蛋白濃度達(dá)到較高值，結(jié)合←→解離平衡濃度也達(dá)到較高值，造成在振蕩體系下，改性微球的重結(jié)合量低于同組未改性微球的重結(jié)合量．

圖6 靜態(tài)培養(yǎng)環(huán)境中的雙印跡微球重結(jié)合量Fig.6 Rebinding quantity of dually imprinted Ms in static environment

圖7 靜態(tài)培養(yǎng)環(huán)境中的雙印跡微球印跡效率Fig.7 Imprinting efficiency of dually imprinted Ms in static environment

在靜置體系中擴(kuò)散速率較小，此時(shí)決定重結(jié)合速率的是結(jié)合-解離過(guò)程．未經(jīng)改性的微球網(wǎng)絡(luò)疏松，容易達(dá)到重結(jié)合平衡，但隨著微球本體溶蝕程度加劇，不可能長(zhǎng)期保持較高的重結(jié)合量，轉(zhuǎn)而進(jìn)入解離階段；改性微球網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)緊密，孔隙較小，雖然受內(nèi)擴(kuò)散制約，不易達(dá)到吸附平衡，但隨著時(shí)間的增長(zhǎng)，重結(jié)合量會(huì)持續(xù)增加，且可以長(zhǎng)時(shí)間保持，微球便呈現(xiàn)出較高的最大重結(jié)合量和較低的解離速率．

2.5.3 重結(jié)合行為的離子交換色譜表征

為了研究改性微球的印跡選擇性，將 BSA分子印跡凝膠微球在牛血清白蛋白及卵白蛋白溶液中進(jìn)行重結(jié)合實(shí)驗(yàn)，對(duì)溶液進(jìn)行離子交換色譜分析，結(jié)果如圖 8所示．用互穿網(wǎng)絡(luò)改性印跡微球浸泡過(guò)的溶液，其中 1種組分的 UV吸收強(qiáng)度呈現(xiàn)出顯著變化；而未經(jīng)改性的印跡微球，2種組分的吸收強(qiáng)度的變化均不明顯．這說(shuō)明互穿網(wǎng)絡(luò)改性對(duì)提高印跡選擇性有較好的效果．

為方便計(jì)算，將2種蛋白的最大紫外吸收強(qiáng)度設(shè)為10，其他樣品的強(qiáng)度與之作商得到相對(duì)吸收強(qiáng)度，如表3所示，其中分離系數(shù)α表征印跡微球在雙組分溶液中的特異重結(jié)合性能．經(jīng)過(guò)互穿網(wǎng)絡(luò)改性后的印跡微球，其分離系數(shù)顯著提高(18.88)，證實(shí)了改性對(duì)增強(qiáng)印跡孔穴穩(wěn)定性和位點(diǎn)構(gòu)象精確性起到的促進(jìn)作用．

互穿網(wǎng)絡(luò)的引入不僅改善了凝膠基材的機(jī)械性能，同時(shí)也改變了基材內(nèi)部微環(huán)境的親疏水性．海藻酸鹽水凝膠體系中，由纖維素醚和戊二醛共價(jià)交聯(lián)的聚合物鏈段導(dǎo)致基材整體的疏水性增加，進(jìn)而影響到印跡空穴和位點(diǎn)的疏水性．對(duì)于構(gòu)象復(fù)雜的蛋白質(zhì)分子，外圍區(qū)域的親水性結(jié)構(gòu)使之易結(jié)合在親水性微環(huán)境的基材上．而蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的疏水性區(qū)域也可能在特定環(huán)境中成為重結(jié)合的有利因素．

海藻酸鹽凝膠基材因其富含親水集團(tuán)和脂肪鏈柔軟的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，對(duì)于完成結(jié)構(gòu)復(fù)雜、體積龐大的蛋白質(zhì)分子的印跡和洗脫過(guò)程十分有利．因?yàn)榈鞍踪|(zhì)分子精細(xì)的構(gòu)象和多官能團(tuán)的外圍輪廓需要基材鏈段的構(gòu)象調(diào)整．然而模板的洗脫以至后續(xù)的重結(jié)合操作卻無(wú)法避免印跡精確結(jié)構(gòu)的損壞．在海藻酸鈣水凝膠體系中引入共價(jià)交聯(lián)的纖維素醚類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)，可以通過(guò)比 Ca2+交聯(lián)更強(qiáng)的共價(jià)鍵以及聚合物鏈段之間的分子間作用，限制基材的溶脹并提高其機(jī)械強(qiáng)度，有效保護(hù)了印跡位點(diǎn)的精確構(gòu)象．

圖8 OVA-BSA溶液與BSA印跡微球進(jìn)行重結(jié)合前后色譜峰變化Fig.8 Chromatographic peaks of OVA-BSA solution before and after rebinding with BSA imprinted Ms

表3 BSA印跡微球重結(jié)合實(shí)驗(yàn)方案及離子交換色譜吸收峰相對(duì)強(qiáng)度Tab.3 Rebinding tests of BSA imprinted Ms and the relative intensity of ion-exchange chromatography

3 結(jié) 語(yǔ)

由于纖維素醚與海藻酸鹽的羥基間的氫鍵作用，纖維素醚分子可較好地溶解于海藻酸鹽溶液中．采用將少量纖維素醚加入海藻酸鹽凝膠體系，并用戊二醛對(duì)纖維素醚分子進(jìn)行共價(jià)交聯(lián)，形成互穿網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，達(dá)到使機(jī)械強(qiáng)度提高、抗溶脹性能增強(qiáng)、釋放時(shí)間延長(zhǎng)的目的．在不同種類(lèi)的纖維素醚衍生物中，0.2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的羥乙基纖維素與 5%戊二醛對(duì)海藻酸鈣凝膠體系的改性效果最佳．

重結(jié)合實(shí)驗(yàn)表明，在振蕩體系下，改性的微球重結(jié)合量略低于未改性微球．其原因是改性微球致密的網(wǎng)絡(luò)成為制約內(nèi)外擴(kuò)散的主要因素，降低了重結(jié)合量．在靜置體系下，改性微球的重結(jié)合量和印跡效率均高于未改性微球，其原因是此時(shí)微球的溶蝕成為重結(jié)合量的決定因素．改性微球的交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)延緩了微球解體和目標(biāo)分子解離的進(jìn)程．這種改性方法對(duì)于抑制微球溶蝕、破碎并維持蛋白質(zhì)分子重結(jié)合量起到一定的作用．另外，考慮到因共價(jià)交聯(lián)互穿網(wǎng)絡(luò)的引入而改變的微環(huán)境親疏水性，筆者認(rèn)為依靠分子熱運(yùn)動(dòng)接近并與基材結(jié)合的蛋白分子，有可能改變其外圍結(jié)構(gòu)的親疏水性，使之適合改性的印跡結(jié)構(gòu)．

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