原子熒光光譜法測(cè)定中華絨螯蟹中四種砷形態(tài)

高鈺一，崔琴，吳蓓琦，譚秀慧，任娣，王鷺，張秋云，陳風(fēng)蔚

（江蘇省淡水水產(chǎn)研究所，江蘇 南京 210017）

砷（As），具有較強(qiáng)的毒性和致癌性[1]，可通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體，對(duì)人體呼吸系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等造成損害[2-3]，被國(guó)際癌癥研究中心（IARC）劃分為Ⅰ類致癌物。水產(chǎn)品是人體攝入As的重要來(lái)源[4]，水產(chǎn)品中砷已引起研究者的廣泛關(guān)注[5-6]。研究表明，As元素毒性不僅與元素總量相關(guān)，而且與其存在形態(tài)密切相關(guān)，無(wú)機(jī)As的毒性大于有機(jī)As，并且三價(jià)砷[As（III）]的毒性大于五價(jià)砷[As（V）][7-8]?！妒称钒踩珖?guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中污染物限量》（GB 2762—2017）規(guī)定，水產(chǎn)動(dòng)物及其制品中無(wú)機(jī)As（以As計(jì)）限量為0.5 mg/kg，當(dāng)總As水平不超過(guò)無(wú)機(jī)As限量值時(shí)，不必測(cè)定無(wú)機(jī)As；否則，需再測(cè)定無(wú)機(jī)As。陳風(fēng)蔚等[9]對(duì)江蘇地區(qū)市售中華絨螯蟹總As進(jìn)行了測(cè)定，質(zhì)量比為0.027～1.305 mg/kg。劉香麗等[10]對(duì)安徽養(yǎng)殖中華絨螯蟹總As含量進(jìn)行調(diào)查，其質(zhì)量比為0.073～1.433 mg/kg。這說(shuō)明，部分中華絨螯蟹樣品總As水平已經(jīng)超過(guò)無(wú)機(jī)As限量值，因此，有必要對(duì)As的形態(tài)進(jìn)行進(jìn)一步分析。

目前，As形態(tài)分析中，常用的分析方法有高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜（HPLC-ICPMS）[11-12]、高效液相色譜-電感耦合等離子體發(fā)射光譜（HPLC-ICP-AES）[13]、高效液相色譜-氫化物發(fā)生-原子熒光光譜（HPLC-HG-AFS）[6，14]、高效液相色譜-氫化物發(fā)生-原子吸收光譜（HPLCHG-AAS）[15]等。其中液相色譜-原子熒光光譜（LC-AFS）操作簡(jiǎn)單、運(yùn)行成本低，并且有較高的靈敏度，易于在普通實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用，適合中華絨螯蟹中砷形態(tài)的檢測(cè)。

現(xiàn)有水產(chǎn)品中As形態(tài)分析方法大多耗時(shí)較長(zhǎng)，使用梯度洗脫進(jìn)行液相色譜分離，操作較為復(fù)雜。現(xiàn)探索比較了不同提取劑對(duì)As化合物的提取效果，以及不同流動(dòng)相下As化合物的分離效果，確定了適合中華絨螯蟹中As形態(tài)分析的檢測(cè)方法，旨在為中華絨螯蟹食用安全性評(píng)價(jià)提供技術(shù)支撐。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

LC-AFS-6500液相色譜-原子熒光光譜（北京海光儀器有限公司）；Hamilton PRP-X100陰離子分析柱（250 mm×4 mm，10μm）；MP225 pH計(jì)（瑞士Mettler Toledo公司）；Milli-Q Integral 5超純水儀（美國(guó)Millipore公司）；DK-8D數(shù)顯恒溫水浴鍋（華普達(dá)儀器制造廠）；Allegra 64R臺(tái)式超速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Beckman公司）；Vortex-Genie 2渦旋混合儀（美國(guó)Scientific Industries公司）；TE612-L電子天平（德國(guó)Sartorius公司）。

As標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：亞砷酸根As（III）（GBW08666）、一甲基砷（MMA）（GBW08668）、二甲基砷（DMA）（GBW08669）、砷酸根As（V）（GBW08667）均購(gòu)于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心。其他試劑均為分析純及以上。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備 中華絨螯蟹去殼去鰓后，取可食部分，用高速萬(wàn)能試樣粉碎機(jī)打成勻漿。

1.2.2 樣品前處理 稱取約1.000 g樣品，置于50 mL塑料離心管中，加入25 mL 0.15 mmol/L硝酸溶液，放置過(guò)夜。90℃熱浸提2.5 h，冷卻后取上層清液5 mL，加入5 mL正己烷，渦旋混勻后，以8 000 r/min轉(zhuǎn)速于4℃離心10 min，棄去上層正己烷，重復(fù)2次。取下層清液過(guò)0.45μm有機(jī)濾膜，待測(cè)。

1.3 儀器工作條件

液相條件：流動(dòng)相為5 mmol/L磷酸氫二鈉和45 mmol/L磷酸二氫鉀溶液，等度洗脫，流量1 mL/min，柱溫20℃，進(jìn)樣體積100μL。

原子熒光光譜儀條件：還原劑為20 g/L硼氫化鉀和5 g/L氫氧化鈉混合溶液；載流為5%鹽酸；主電流：80 mA；輔助電流：40 mA；載氣流量：300 mL/min；屏蔽氣流量：900 mL/min；蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速：60 r/min；原子化器高度：8 mm；數(shù)據(jù)采集頻率：10 Hz。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

As提取溶劑主要有水[16]、甲醇溶液[17]、硝酸溶液[18]等，試驗(yàn)對(duì)比了純水、50%甲醇、0.15 mmol/L硝酸溶液的提取效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，純水提取效率最低；甲醇溶液會(huì)導(dǎo)致無(wú)機(jī)砷峰形拖尾；硝酸溶液提取效果、效率均最高，且峰形對(duì)稱、尖銳。選取0.15 mmol/L硝酸溶液作為提取劑。

2.2 色譜分離條件的選擇

2.2.1 色譜柱 As形態(tài)的分離一般可以采用離子交換色譜、離子對(duì)色譜、反相離子對(duì)色譜等液相色譜與電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用。該試驗(yàn)研究的As（III）、DMA、MMA和As（V）4種As化合物都是弱酸或中強(qiáng)酸，在適宜pH值水溶液中均以陰離子形式存在，故試驗(yàn)選取Hamilton PRP-X100陰離子交換柱對(duì)4種As形態(tài)進(jìn)行分離。待分析陰離子被淋洗液帶入色譜柱后，與功能基結(jié)合，在淋洗液的不斷洗脫下，離子又被洗脫下來(lái)，不同離子與功能基結(jié)合的時(shí)間長(zhǎng)短不一樣，基于此原理，各離子得到分離。

2.2.2 流動(dòng)相 As形態(tài)分析常采用緩沖鹽作為流動(dòng)相[19]，試驗(yàn)選用磷酸氫二鈉和磷酸二氫鉀溶液為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫。該試驗(yàn)考察了流動(dòng)相濃度和pH值對(duì)色譜分離效果的影響。結(jié)果顯示，5 mmol/L磷酸氫二鈉和45 mmol/L磷酸二氫鉀緩沖溶液作為流動(dòng)相，用10%磷酸調(diào)節(jié)pH值為5.92，采用等度洗脫，4種As形態(tài)在短時(shí)間內(nèi)能夠?qū)崿F(xiàn)分離，且分離效果最好。在該流動(dòng)相條件下，4種As形態(tài)均以陰離子形式存在，與離子交換劑基團(tuán)發(fā)生作用，按照與基團(tuán)之間相互作用力的大小，以As（III）、DMA、MMA和As（V）的順序被洗脫下來(lái)，4種As形態(tài)完全分離，峰形對(duì)稱，尖銳。4種As形態(tài)的空白樣品色譜圖見圖1，標(biāo)準(zhǔn)色譜圖見圖2。

圖1 空白樣品色譜圖

圖2 4種As形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

2.3 線性范圍及檢出限

砷混合標(biāo)準(zhǔn)溶液分別配制成0，10，20，40，80和100μg/L，上機(jī)測(cè)定。以各定量離子色譜的峰面積（Y）對(duì)濃度（x）進(jìn)行線性回歸。結(jié)果表明，在試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)濃度范圍內(nèi)，各種As化合物線性回歸方程相關(guān)系數(shù)均在0.999以上?；貧w方程及檢出限見表1，該方法檢出限小于《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中總砷及無(wú)機(jī)砷的測(cè)定》（GB 5009.11—2014）中水產(chǎn)動(dòng)物的方法檢出限0.03 mg/kg，能夠滿足水產(chǎn)品中砷形態(tài)的檢測(cè)要求。

表1 線性曲線方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)及檢出限

2.4 精密度與加標(biāo)回收率

選擇中華絨螯蟹樣品（四種As形態(tài)含量均低于檢出限），進(jìn)行加標(biāo)試驗(yàn)，加標(biāo)水平分別為0.05，0.10和0.25 mg/kg，按試驗(yàn)方法每個(gè)加標(biāo)濃度平行測(cè)定6次，結(jié)果見表2。各樣品中四種As形態(tài)的加標(biāo)回收率和RSD分別為As（III）：86.1%～93.4%，1.78%～4.25%；DMA：97.1%～99.5%，1.41%～3.65%；MMA：88.4%～95.7%，1.21%～3.32%；As（V）：93.3%～97.3%，1.55%～2.59%。方法具有較好的精密度和準(zhǔn)確度。

表2 加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果①（n=6）

3 結(jié)論

該研究采用優(yōu)化的試驗(yàn)條件對(duì)市售中華絨螯蟹40個(gè)樣品進(jìn)行了檢測(cè)。測(cè)定結(jié)果顯示，少數(shù)樣品檢出少量的As（III）。說(shuō)明雖然中華絨螯蟹中總As含量較高，但毒性較大的無(wú)機(jī)As含量均小于0.5 mg/kg，納入研究的樣本符合食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)要求。