芻議銀中楊的組織培養(yǎng)技術(shù)

寧 軍 寧 濤

（開原市園林局，遼寧開原112300）

1.緒論。銀中楊是以銀白楊為母本，中東楊為父本的人工雜交而成，該樹種生長迅速，材質(zhì)結(jié)構(gòu)細(xì)密，結(jié)實(shí)，抗旱，耐寒（抗低溫-39?C），是優(yōu)良造林樹種，其樹干通直，樹皮光滑，灰綠色，葉被面呈銀白色，樹形美觀，風(fēng)格獨(dú)特，雄系，無性系不飛絮，是城鄉(xiāng)綠化，美化，凈化環(huán)境的優(yōu)良樹種。本試驗(yàn)的地點(diǎn)是遼寧省開原市石臺(tái)苗圃，試驗(yàn)時(shí)間是2006年至2007年。

2、材料與方法

2.1 試驗(yàn)材料

2.1.1 植物材料

本試驗(yàn)的材料來源：銀中楊二年生植株上的當(dāng)年生幼嫩枝條。本試驗(yàn)采取的外植體有兩種，即幼嫩莖段（包括莖尖）。

2.1.2 試驗(yàn)所用的試劑：MS配方中的大量元素、微量元素、鐵鹽、有機(jī)物。植物激素類物質(zhì)：6-BA，NAA。消毒劑及表面滅菌劑：75%的酒精，0.1%的升汞溶液。

2.2 試驗(yàn)方法

2.2.1 外植體的采取及處理

6月上旬開始在苗圃地選擇生長健壯、無病蟲害的二年生植株作為外植體來源，選擇晴天上午剪取當(dāng)年生幼嫩枝條，帶回實(shí)驗(yàn)室后用自來水沖洗，去掉表面泥沙污物，放入燒杯中，加入適量洗滌劑攪勻，浸泡6-7min后倒掉洗滌劑溶液，在流水下沖洗30min左右，以清洗掉材料表面的油脂性污物。

2.2.2 外植體的表面滅菌

將沖洗過的材料移入超凈工作臺(tái)上進(jìn)行表面滅菌，表面滅菌劑用0.1%的升汞溶液，為了提高滅菌效果，在表面滅菌前將材料用70%的酒精進(jìn)行漂洗，具體方法是：取滅過菌的玻璃燒杯，倒入70%的酒精，將材料浸入酒精中，輕輕晃動(dòng)4-5min后倒出酒精，表面滅菌為了增加滅菌效果，在表面滅菌劑升汞中加入2-3滴吐溫-80，充分?jǐn)噭颍脽o菌水沖清洗材料6-8次，每次清洗時(shí)讓材料在無菌水中浸泡1-2min，盡量減少升汞在植物組織中的殘留。清洗后的材料用濾紙吸取表面多余的水分，以備接種。

2.2.3 培養(yǎng)基

銀中楊組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基中細(xì)胞分裂素的種類是6-BA，生長素的種類是NAA，二者的不同濃度和比例可以誘導(dǎo)不同的外植體脫分化。幼莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS+6-BA1.0+NAA0.05（單位：mg/L，以下同）。繼代增殖培養(yǎng)基：MS+6-BA0.5+NAA0.05。生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基：1/2MS+NAA-0.50 pH值為5.8

2.2.4 接種

2.2.4.1 幼莖接種

將表面滅菌后的材料放在濾紙上，用鑷子剝?nèi)ト~片，用手術(shù)刀將幼莖切成1-2cm長的莖段，每個(gè)莖段保持1-2個(gè)節(jié)，用鑷子將莖段基部直插到培養(yǎng)基中，是莖段的頂端向上，保持形態(tài)學(xué)的極性。還要注意使莖段上的腋芽留在培養(yǎng)基上，每個(gè)培養(yǎng)瓶中接種一個(gè)莖段。接種后用耐壓塑料薄膜封住瓶口，作好標(biāo)記，注明接種材料、名稱和接種日期。

2.2.5 培養(yǎng)條件

2.2.5.1 溫度。組織培養(yǎng)過程所要求的溫度為25±2℃。一般低于15℃時(shí)組織的生長停滯，高于30℃時(shí)對(duì)生長不利。銀中楊的培養(yǎng)溫度為25-27℃。

2.2.5.2 光照。銀中楊組培過程中的每日連續(xù)光照為：9-10h/d，光照強(qiáng)度1000-2000Lx。

3、培養(yǎng)過程

3.1 莖段、莖尖培養(yǎng)

外植體接種到幼莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基后20d左右，莖尖和莖段基部腫脹、膨大，頂芽和側(cè)芽逐漸發(fā)育，繼續(xù)培養(yǎng)至30-40后，形成2-3個(gè)芽的小芽叢。每4-5周為一個(gè)繼代周期，及時(shí)轉(zhuǎn)接到新的繼代培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，經(jīng)過2-3個(gè)周期的繼代培養(yǎng)，小芽叢中的芽的數(shù)量逐漸增加，芽逐漸伸長，長到2-3cm，繼代轉(zhuǎn)接時(shí)將小芽叢切割分開，轉(zhuǎn)接到新培養(yǎng)基中，兩周后觀察不同培養(yǎng)基上的叢生芽數(shù)量，芽的增殖倍數(shù)為4-9倍。莖尖和莖段接種后4-5個(gè)月可建立無性系。

3.2 生根培養(yǎng)

幼莖誘導(dǎo)的無根芽苗分切成單苗，接種到生根培養(yǎng)基中，一周左右即有不定根發(fā)生，2-3周有多條不定根發(fā)生，形成根系。為了促進(jìn)不定根的分化，生根培養(yǎng)基中還可以加入2mg/L活性炭。

2.6.3 糖尿病患者 對(duì)前列腺增生患者應(yīng)重視是否有伴有糖尿病。入院時(shí)需詢問患者有無糖尿病以及相關(guān)用藥情況，并在病史中予以記錄。術(shù)前應(yīng)進(jìn)行血糖、糖化血紅蛋白、血尿酸、肝腎功能等評(píng)估。注意飲食調(diào)節(jié)、血糖監(jiān)控，圍手術(shù)期間積極維持原代謝疾病的藥物治療，必要時(shí)與相關(guān)科室聯(lián)系進(jìn)行相關(guān)藥物的劑量調(diào)整。

3.3 試管苗的過渡移栽

3.3.1 過渡移栽的措施

移栽前將培養(yǎng)瓶移入溫室或大棚內(nèi)，打開瓶口煉苗1-2天。移栽時(shí)用鑷子取出小苗，洗去培養(yǎng)基，植入移栽基質(zhì)中，移栽基質(zhì)為園田土：河沙：珍珠巖2：1：1，移栽后用細(xì)噴頭噴透水。移栽后要保持空氣濕度在80-90%，用塑料膜罩上，并適當(dāng)遮光，一周內(nèi)保持75%遮光度，一周后增加光照，保持50%遮光度，以后逐漸增加光照。溫度保持在20-25℃。移栽初期保持基質(zhì)濕潤，但不積水。在移栽后的一周之內(nèi)不施肥，一周后可以葉面噴施0.1%的磷酸二氫鉀，每周2次，以促進(jìn)根系發(fā)育，根系形成后可以隨澆水根施氮、磷鉀復(fù)合肥，每周1次，一個(gè)月后可定植到苗圃，進(jìn)入正常管理。

4、問題與討論

4.1 外植體表面滅菌方法

本試驗(yàn)采取以下三種不同的表面滅菌方法：第一種，0.1%升汞浸泡11min，無菌水沖洗6次。第二種，75%酒精浸泡1min，再用0.1%升汞浸泡11min，無菌水沖洗6次。第三種，75%酒精浸泡1min，再用0.1%升汞浸泡11min，升汞中加2-3滴吐溫80，無菌水沖洗6次。上述三種表面滅菌方法的滅菌效果有明顯差異，接種后2-3周的污染率和褐化率見表：

表4.1 三種滅菌方法污染率與褐化率

實(shí)驗(yàn)證明，銀中楊外植體表面滅菌采用第二種方法較為合適，即先用75%酒精浸泡1min，再用0.1%升汞浸泡11min，無菌水沖洗6次。

4.2 繼代培養(yǎng)基中細(xì)胞分裂素與生長素（6-BA與NAA）對(duì)芽增殖的影響。

細(xì)胞分裂素和生長素的種類、濃度對(duì)培養(yǎng)物的生長狀況、增殖倍數(shù)起著重要的作用，適當(dāng)降低激素濃度，特別是降低生長素的濃度，培養(yǎng)物的生長和芽苗的增殖都有明顯的變化，使愈傷組織的生長受到抑制，質(zhì)地均勻、顏色變綠，而且芽苗增殖提高。本試驗(yàn)以莖段培養(yǎng)物為材料，將細(xì)胞分裂素（6-BA）和生長素（NAA）做兩因素三水平的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，結(jié)果見表4.2。

表4.2

1 號(hào)MS+6-BA0.5+NAA0.01

2 號(hào)MS+6-BA0.5+NAA0.05

3 號(hào)MS+6-BA0.5+NAA0.1

4 號(hào)MS+6-BA1+NAA0.01

5 號(hào)MS+6-BA1+NAA0.05

6 號(hào)MS+6-BA1+NAA0.1

7 號(hào)MS+6-BA1.5+NAA0.01

8 號(hào)MS+6-BA1.5+NAA0.05

9 號(hào)MS+6-BA1.5+NAA0.1

上述9個(gè)處理均在相同條件下培養(yǎng)和轉(zhuǎn)接，經(jīng)過3個(gè)周期的培養(yǎng)和觀察，結(jié)果如下表：

表4.3 各培養(yǎng)基中芽增殖及表現(xiàn)

實(shí)驗(yàn)證銀中楊適宜的繼代培養(yǎng)基為MS+6-BA0.5-1.0+NAA0.01-0.05。

［1］李世承，植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)技術(shù)［M］，大連：大連理工大學(xué)出版社，1990.76-77，84-85。

［2］唐定臺(tái)，等.植物激素對(duì)哈密瓜(Cncumis meloL)子葉形成愈傷組織和植株再生的作用［J］，植物學(xué)報(bào)，1980.22-2,132-134.

［3］曹宗巽，等.植物生理學(xué)［M］.北京：人民教育出版社，1979.335-345