?；撬釋?duì)化療后S180荷瘤小鼠增效減毒作用的研究

肖永學(xué)，劉 克

(1.膠南市靈山衛(wèi)中心衛(wèi)生院，山東 膠南 266427;2.青島市城陽(yáng)區(qū)第二人民醫(yī)院，青島 266112)

目前，常用抗腫瘤藥多為化學(xué)合成的細(xì)胞毒類(lèi)藥物，對(duì)正常細(xì)胞和癌細(xì)胞選擇性差，抑制骨髓造血系統(tǒng)，使白細(xì)胞數(shù)下降，導(dǎo)致腫瘤患者免疫力下降。?；撬?Tau)是一種含硫氨基酸，它對(duì)維持機(jī)體免疫系統(tǒng)的功能有非常重要的作用，是很好的免疫佐劑。本研究以S180荷瘤小鼠為模型，采用?；撬崤c環(huán)磷酰胺CTX聯(lián)合用藥，觀察牛磺酸對(duì)環(huán)磷酰胺是否具有增效減毒作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物 昆明種小鼠，體重(20±2)g，雌雄各半，由山東省青島市藥品檢驗(yàn)所提供。

1.2 瘤株 小鼠肉瘤細(xì)胞株(S180)由中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)贈(zèng)送，本室以腹水傳代保種。

1.3 試劑 脂多糖，Sigma公司;刀豆蛋白A，Sigma公司;PRMI－1640培養(yǎng)基，Gibco生物公司;?；撬幔旖蚴腥鸾鹛鼗瘜W(xué)品有限公司，批號(hào):津Q/HX0016－2005;環(huán)磷酰胺，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào):06043021;白細(xì)胞分離液，上海華精生物高科技有限公司，批號(hào):060912。

1.4 儀器 離心機(jī);恒溫水浴鍋;多功能顯微鏡(日本，O-lympus公司);二氧化碳培養(yǎng)箱(德國(guó)赫利公司);酶標(biāo)儀(美國(guó)BIO－RAD);無(wú)菌超凈臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有公司);電子分析天平(上海天平儀器總廠)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 藥物配制 牛磺酸為白色結(jié)晶粉末，溶于水，實(shí)驗(yàn)前用生理鹽水配制成所需濃度溶液;環(huán)磷酰胺實(shí)驗(yàn)前用生理鹽水配制成所需濃度溶液。

2.2 S180荷瘤小鼠模型的建立［7～9］選擇本室腹水型傳代7～10 d且健康狀況良好的S180荷瘤小鼠，腹部皮膚用碘酊、酒精消毒后，抽取腹水，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上臺(tái)盼藍(lán)染色法證實(shí)活細(xì)胞率95%以上。以適量無(wú)菌生理鹽水稀釋成瘤細(xì)胞懸液，濃度為1×107個(gè)·mL－1。小鼠右腋窩皮下接種0.2mL(含瘤細(xì)胞2×106)S180細(xì)胞懸液。

2.3 動(dòng)物分組及給藥 接種腫瘤后，將S180荷瘤小鼠隨機(jī)分為5組:模型組，CTX組，CTX+Tau低、中、高劑量組，每組10只。CTX組:給予CTX 20mg·kg－1;模型組:給予生理鹽水0.2mL;CTX+Tau低、中、高劑量組:分別給予 CTX 20mg·kg－1，Tau 50、100、200mg·kg－1。各組小鼠均于接種腫瘤 24 h后分別腹腔注射給藥，每日1次，連續(xù)8 d。常規(guī)飼養(yǎng)，飲水、食物不限。

2.4 牛磺酸與環(huán)磷酰胺合用對(duì)S180荷瘤小鼠的抑瘤作用各組小鼠均于接種腫瘤細(xì)胞24 h后分別腹腔注射給藥，每日1次，連續(xù)8 d，常規(guī)飼養(yǎng)，飲水、食物不限。第8天停止給藥和注射生理鹽水，24 h后，各組小鼠稱(chēng)重，頸椎脫臼處死，剝?nèi)×鰤K，除去脂肪纖維組織稱(chēng)重，按下列公式計(jì)算腫瘤抑制率(%):抑瘤率=(對(duì)照組平均瘤重－治療組平均瘤重)/對(duì)照組平均瘤重×100%。

2.5 ?；撬崤c環(huán)磷酰胺合用對(duì)S180荷瘤小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)［10］和骨髓有核細(xì)胞數(shù)的影響 給藥24 h后斷尾取血，進(jìn)行白細(xì)胞計(jì)數(shù)。于小試管中加入白細(xì)胞稀釋液0.38mL，然后用血紅蛋白吸管自斷尾處取0.02mL血液，立即吹入稀釋液中，并將吸管壁的血吸入稀釋液內(nèi)，輕輕搖勻，用小滴管自搖勻的稀釋液中吸取少量液體加入血細(xì)胞計(jì)數(shù)池內(nèi)，靜置1～2min，在顯微鏡下觀察并計(jì)算白細(xì)胞總數(shù)。在低倍鏡下，白細(xì)胞呈圓形，漿透亮，核呈紫黑色，稍有折光，借此特點(diǎn)可與雜質(zhì)相區(qū)別。計(jì)數(shù)計(jì)數(shù)池四角的4個(gè)大方格中所有的白細(xì)胞數(shù)，將總數(shù)乘以50，即得每毫升血中白細(xì)胞數(shù)。小鼠頸椎脫臼處死，剝離右側(cè)股骨，用1640培養(yǎng)液通過(guò)針頭反復(fù)沖洗骨髓并測(cè)定洗液中骨髓有核細(xì)胞數(shù)。

2.6 牛磺酸與環(huán)磷酰胺合用對(duì)S180荷瘤小鼠免疫器官指數(shù)的影響 末次給藥24 h后頸椎脫臼處死小鼠，無(wú)菌取胸腺和脾，用電子分析天平分別稱(chēng)重。根據(jù)以下公式計(jì)算胸腺指數(shù)、脾指數(shù):胸腺指數(shù)(thymus index，TI)=胸腺重(g)/體重(g);脾臟指數(shù)(spleen index，PI)=脾重(g)/體重(g)。

2.7 S180荷瘤小鼠NK細(xì)胞殺傷活性測(cè)定和淋巴細(xì)胞增殖活性測(cè)定

2.7.1 S180荷瘤小鼠脾細(xì)胞懸液制備 無(wú)菌摘除脾臟，剔除結(jié)締組織，PBS沖洗1次，200目不銹鋼篩網(wǎng)上，把脾臟用研缽碾碎，篩網(wǎng)下置安剖，用PBS反復(fù)沖洗于高壓滅菌安瓿中。所得混入脾細(xì)胞的液體加入到含有白細(xì)胞分離液的離心管中，離心，得到脾細(xì)胞懸液。反復(fù)沖洗數(shù)次，制成單個(gè)脾淋巴細(xì)胞懸液。臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，活細(xì)胞95%以上，調(diào)整濃度5×106個(gè)·mL－1。

2.7.2 S180荷瘤小鼠NK細(xì)胞殺傷活性測(cè)定 MTT比色法。取脾細(xì)胞懸液，濃度為5×106個(gè)·L－1，作為效應(yīng)細(xì)胞(E)。制備常規(guī)培養(yǎng)S180細(xì)胞懸液(活性＞95%)，濃度為1×105個(gè)·L－1，作為靶細(xì)胞(T)。效靶細(xì)胞濃度比為50∶1。每只鼠設(shè)靶細(xì)胞孔(T)，效應(yīng)細(xì)胞孔(E)，效應(yīng)細(xì)胞+靶細(xì)胞實(shí)驗(yàn)孔(E+T)，另設(shè)空白對(duì)照孔。按表1加樣于96孔圓底培養(yǎng)板，每孔終體積200μL。每樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔。將培養(yǎng)板移入CO2培養(yǎng)箱，37℃ 5%CO2飽和濕度條件下孵育24 h后，各孔加入MTT溶液(5mg·mL－1)20μL同樣條件繼續(xù)孵育4h后終止培養(yǎng)。然后吸棄上清液，每孔加入150μL DMSO。吹打均勻，于酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)定OD值。計(jì)算方法:NK細(xì)胞活性(%)=［靶細(xì)胞對(duì)照孔OD值－(實(shí)驗(yàn)孔OD值－效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照孔OD值)］/靶細(xì)胞對(duì)照孔OD值×100%。加樣見(jiàn)表1。

2.7.3 S180荷瘤小鼠T淋巴細(xì)胞增殖活性測(cè)定 取脾細(xì)胞懸液，濃度為5×106個(gè)·L－1，ConA溶液濃度調(diào)整為5mg·L－1。每只鼠設(shè):ConA實(shí)驗(yàn)孔，空白對(duì)照孔。按表2加樣于96孔平底培養(yǎng)板，每孔終體積200μL。每樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔。將培養(yǎng)板移入CO2培養(yǎng)箱孵育72 h后，加入MTT溶液(5mg·mL－1)20μL，同樣條件繼續(xù)孵育4 h后終止培養(yǎng)。然后棄上清液，每孔加入150μL DMSO。吹打均于酶標(biāo)儀570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值，計(jì)算淋巴細(xì)胞增殖率。淋巴細(xì)胞增殖率(%)=［(實(shí)驗(yàn)孔OD值－對(duì)照孔OD值)/對(duì)照孔OD值］×100%。加樣見(jiàn)表2。

表1 測(cè)定NK細(xì)胞活性各組加樣情況

表2 測(cè)定T淋巴細(xì)胞增殖活性測(cè)定各組加樣情況

S180荷瘤小鼠B淋巴細(xì)胞增殖活性測(cè)定:方法同T淋巴細(xì)胞，絲裂原為 20mg·L－1的 LPS。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 ?；撬崤c環(huán)磷酰胺合用對(duì)S180荷瘤小鼠的抑瘤作用與模型組比較，CTX組與Tau+CTX各劑量組都具有顯著的腫瘤抑制作用。并且Tau+CTX低、中、高劑量組抑瘤率均高于CTX組，并呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。說(shuō)明Tau可以協(xié)同CTX發(fā)揮抑制腫瘤的作用，結(jié)果見(jiàn)表3。

3.2 ?；撬崤c環(huán)磷酰胺合用對(duì)S180荷瘤小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)和骨髓有核細(xì)胞數(shù)的影響:CTX組外周血白細(xì)胞數(shù)量與模型對(duì)照組比較顯著降低，CTX+Tau中、高劑量組外周血白細(xì)胞數(shù)量與CTX組比較，明顯升高;CTX組骨髓有核細(xì)胞數(shù)量與模型對(duì)照組比較顯著降低，CTX+Tau中、高劑量組骨髓有核細(xì)胞數(shù)量與CTX組比較，明顯升高。說(shuō)明Tau可以減輕CTX抑制荷瘤小鼠骨髓的毒性，提高荷瘤小鼠CTX化療后外周血白細(xì)胞數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表4。

表3 Tau與CTX合用對(duì)S180荷瘤小鼠的抑瘤作用

表4 Tau與CTX合用對(duì)S180荷瘤小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)和骨髓有核細(xì)胞數(shù)的影響

3.3 ?；撬崤c環(huán)磷酰胺合用對(duì)S180荷瘤小鼠免疫器官指數(shù)的影 與模型組比較，CTX組荷瘤小鼠脾指數(shù)和胸腺指數(shù)均顯著降低(P＜0.05);而CTX+Tau各劑量組高于CTX組(P＜0.05)，尤其是CTX+Tau高劑量組(P ＜0.01)，說(shuō)明CTX對(duì)S180荷瘤小鼠的免疫器官具有免疫毒性，而Tau可以抑制CTX的這種作用，并且呈劑量依賴(lài)性。說(shuō)明?；撬峥梢源龠M(jìn)荷瘤小鼠脾臟和胸腺的生長(zhǎng)，改善CTX對(duì)荷瘤小鼠免疫器官的毒性作用，結(jié)果見(jiàn)表5。

3.4 ?；撬崤c環(huán)磷酰胺合用對(duì)S180荷瘤小鼠NK細(xì)胞殺傷活性的影響 CTX組NK細(xì)胞活性與模型組比較，兩者之間沒(méi)有差異，但是CTX+Tau高劑量組NK細(xì)胞活性與CTX組比較，明顯升高，差異有顯著性，結(jié)果見(jiàn)表6。

3.5 ?；撬崤c環(huán)磷酰胺合用對(duì)S180荷瘤小鼠淋巴細(xì)胞增殖活性的影響 與模型組比較，CTX組T、B淋巴細(xì)胞增殖沒(méi)有明顯差別;與CTX組比較，CTX+Tau低、中、高劑量組T淋巴細(xì)胞增殖活性升高，并且低、中、高劑量組B淋巴細(xì)胞增殖活性均上升，結(jié)果見(jiàn)表7。

表5 Tau與CTX合用對(duì)S180荷瘤小鼠免疫器官指數(shù)的影響

4 結(jié)論

本研究采用S180小鼠移植瘤模型，以化療藥物CTX作陽(yáng)性對(duì)照組，觀察Tau對(duì)CTX的增效減毒作用。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)得到如下結(jié)論:

表6 Tau與CTX合用對(duì)S180荷瘤小鼠NK細(xì)胞殺傷活性的影響

表7 Tau與CTX合用對(duì)S180荷瘤小鼠淋巴細(xì)胞增殖活性的影響

①Tau合用CTX，對(duì)S180荷瘤小鼠抑瘤率明顯高于單一使用CTX，Tau與CTX合用對(duì)腫瘤具有協(xié)同抑制作用;②Tau改善了CTX對(duì)S180荷瘤小鼠骨髓的抑制作用，Tau與CTX合用可明顯升高外周血白細(xì)胞數(shù)和骨髓有核細(xì)胞數(shù);③Tau可以減輕CTX對(duì)S180荷瘤小鼠免疫器官的毒性作用，保護(hù)S180荷瘤小鼠脾臟和胸腺并促進(jìn)其生長(zhǎng);④Tau與CTX合用可以增強(qiáng)S180荷瘤小鼠NK細(xì)胞殺傷活性;⑤Tau與CTX合用可以增強(qiáng)S180荷瘤小鼠的淋巴細(xì)胞增殖率。

綜上所述，Tau與CTX合用對(duì)腫瘤具有協(xié)同抑制作用，改善CTX對(duì)小鼠骨髓的抑制作用，緩解CTX對(duì)機(jī)體的免疫毒性作用，即Tau對(duì)CTX具有增效減毒作用。

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