耐鎘微生物的篩選及其吸附能力研究

摘要：以桃園土壤為試驗材料，從中篩選出３株分別耐０．５、４０．０、６０．０ ｍｇ／Ｌ鎘的細菌Ｃｄ－Ｒ－１、Ｃｄ－Ｒ－２和Ｃｄ－Ｒ－３，并對其耐鎘遺傳穩(wěn)定性、鎘吸附能力、對種子發(fā)芽率的影響等方面進行研究。結(jié)果表明，所獲得的３個菌株均具有穩(wěn)定的耐鎘特性；菌株Ｃｄ－Ｒ－１對鎘吸附能力最強，吸附率達到７６．６％，Ｃｄ－Ｒ－２、Ｃｄ－Ｒ－３則相對較弱，吸附率在２０％～３０％之間；３株細菌對花生、小麥和番茄種子的發(fā)芽率基本沒有影響；Ｃｄ－Ｒ－１和Ｃｄ－Ｒ－２對玉米種子發(fā)芽有明顯的促進作用，而Ｃｄ－Ｒ－３對其發(fā)芽率的影響不大；無論何種菌株，對豌豆種子的發(fā)芽率均有很強的抑制作用。

關(guān)鍵詞：鎘；微生物；篩選；吸附能力

中圖分類號：Ｘ１７２文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）03－0499-04

Screening of Cadmium Resistant Microbes and Analysis of Their Adsorption Capability

ＷＡＮＧ Ｊｕｎ－ｌｉ１ａ，２，ＲＥＮ Ｊｉａｎ－ｇｕｏ１ｂ，２

（１． Ｑｉｎｇｄａｏ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， ａ． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ； ｂ． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｇｒｏｎｏｍｙ ａｎｄ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ， Ｑｉｎｇｄａｏ ２６６１０９， Ｓｈａｎｄｏｎｇ， Ｃｈｉｎａ； ２． Guizhou Fruit Institute， Ｇｕｉｙａｎｇ ５５０００６，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｒｅｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｔｒａｉｎｓ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｔｏ ｃａｄｍｉｕｍ at ０．５ｍｇ／Ｌ， ４０ｍｇ／Ｌ ａｎｄ ６０ｍｇ／Ｌ respectively ｗｅｒｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ， ｖｉｚ． Ｃｄ－Ｒ－１， Ｃｄ－Ｒ－２， ａｎｄ Ｃｄ－Ｒ－３ ｆｒｏｍ ｐｅａｃｈ ｏｒｃｈａｒｄ ｓｏｉｌ． Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ， ｔｈｅ ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｃａｄｍｉｕｍ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ， ｃａｄｍｉｕｍ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ｃａｐａｃｉｔｙ ａｎｄ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｓｅｅｄ ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｅｒｅ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ that ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｔｒａｉｎｓ ｈａｄ ｓｔａｂｌｅ ｈｅｒｅｄｉｔｙ ｏｆ ｃａｄｍｉｕｍ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ. Ｔｈｅ ｃａｄｍｉｕｍ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ｃａｐａｃｉｔｙ ｏｆ Ｃｄ－Ｒ－１ ｗａｓ the ｓｔｒｏｎｇｅｓｔ as ｉｔｓ ａｄｓｏｒｐｔｉｖｅ ｒａｔｅ ｒｅａｃｈｅｄ ７６．６％； ｗｈｉｌｅ the absorptive rates of Ｃｄ－Ｒ－２ ａｎｄ Ｃｄ－Ｒ－３ ｗｅｒｅ ｒｅｌａｔｉｖｅｌｙ ｗｅａｋ，ｒａｎｇｅｄ ｆｒｏｍ ２０％ ｔｏ ３０％. Ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｔｒａｉｎｓ ｈａｄ hardly any ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ ｐｅａｎｕｔ， ｔｏｍａｔｏ ａｎｄ ｗｈｅａｔ ｓｅｅｄ； Ｃｄ－Ｒ－１ ａｎｄ Ｃｄ－Ｒ－２ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｐｒｏｍｏｔｅｄ ｔｈｅ ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ ｍａｉｚｅ ｓｅｅｄｓ， ｗｈｉｌｅ Ｃｄ－Ｒ－３ ｈａｄ few． Ｉｎ ａｄｄｉｔｉｏｎ， ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｔｒａｉｎｓ ｈａｄ ｓｔｒｏｎｇ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｔｈｅ ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅａ ｓｅｅｄｓ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｃａｄｍｉｕｍ； ｍｉｃｒｏｂｅ； ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ； ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ

隨著電鍍工業(yè)、顏料工業(yè)、電子工業(yè)、農(nóng)藥和食品添加劑生產(chǎn)等工業(yè)的發(fā)展，大量的鎘及其化合物隨生產(chǎn)產(chǎn)生的廢水、廢氣、廢渣排放到環(huán)境中，造成大氣、土壤、農(nóng)作物及水產(chǎn)品的污染。排放到土壤中的鎘通過農(nóng)作物的生產(chǎn)，進一步轉(zhuǎn)移到動、植物有機體內(nèi)，嚴重地威脅著人類的身體健康。重金屬污染的傳統(tǒng)治理方法——物理和化學法，由于其所需費用高和能耗大，且易造成二次污染［１－３］，現(xiàn)正逐漸被生物吸附法所代替［４］。微生物特別是細菌，數(shù)量眾多、比表面積大、帶電、代謝活動旺盛，可通過多種方式影響土壤重金屬的活性［５］和對重金屬進行生物吸附［６－８］。本試驗從青島市城陽區(qū)大北曲村桃樹果園（病蟲害發(fā)生嚴重）取土壤樣品，篩選具有耐鎘特性的微生物，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

１材料與方法

１．１主要儀器與試劑

主要儀器：３０３－３型電熱培養(yǎng)箱（江蘇東臺縣電器廠）；２０２型電熱鼓風干燥箱（中國龍口市先科儀器公司）；ＳＷ－ＣＪ型超凈工作臺（蘇凈集團安泰公司制造）；立壓式蒸汽滅菌器（上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司）；ＴＧＬ－１６Ｃ型高速臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）；ＦＡ１６０４型電子天平（上海天平儀器廠）；原子吸收分光光度計（ＡＡ－６８００日本島津公司）。

主要材料及試劑：馬鈴薯（新鮮），蔗糖、瓊脂、葡萄糖、氯化鈉、磷酸二氫銨、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、氯化鎘，均為分析純；濃硝酸，為優(yōu)級純。

１．２方法

１．２．１耐鎘微生物的分離及獲得取６ ｇ預先經(jīng)５０ ｍｇ／ｋｇ土壤鎘處理２０ ｄ的桃樹果園土壤（來自青島市城陽區(qū)大北曲村）于盛有１５０ ｍＬ無菌水的三角瓶中，振蕩５ ｍｉｎ后，采用１０倍系列梯度稀釋法進行稀釋［９］，然后?。埃?ｍＬ １０－６稀釋液注入培養(yǎng)皿（直徑６ｃｍ）中，再分別加入含鎘［ＣｄＣｌ２·２．５Ｈ２Ｏ］濃度為０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、１．０、５．０、１０．０、１５．０、２０．０、３０．０、４０．０、５０．０、６０．０、７０．０ ｍｇ／Ｌ的ＰＤＡ培養(yǎng)基（馬鈴薯２００ ｇ，蔗糖２０ ｇ，瓊脂２０ ｇ，水１ ０００ ｍＬ，１２１℃滅菌２０ ｍｉｎ），搖勻后倒置于２８℃培養(yǎng)箱中。以不加氯化鎘為對照，每個處理設(shè)３次重復。將在各含鎘培養(yǎng)基上獲得的單菌落，按平板劃線法接種于ＰＤＡ培養(yǎng)基上，２８℃恒溫培養(yǎng)觀察其培養(yǎng)性狀。

１．２．２微生物耐鎘遺傳穩(wěn)定性分析將分離獲得的耐鎘菌株先經(jīng)過１０次ＰＤＡ培養(yǎng)基（無鎘）傳代培養(yǎng)后，然后再轉(zhuǎn)入各菌株相應(yīng)耐鎘濃度的ＰＤＡ培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)１０次，觀察各菌株的生長狀況。所有培養(yǎng)溫度均為２８℃。

１．２．３耐鎘微生物對鎘的吸附能力分析將所獲得的菌株菌懸液（濃度約１０８ＣＦＵ／ｍＬ）０．５ ｍＬ分別培養(yǎng)于相應(yīng)鎘濃度的５０ ｍＬ培養(yǎng)液（每升溶液中含葡萄糖５.0 ｇ，ＮａＣｌ ５.0 ｇ，ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４ １.0 ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４ １.0 ｇ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．５ ｇ）中，２８℃下懸浮培養(yǎng)，設(shè)３個重復，以不加菌株的為對照（以０．５ ｍＬ無菌水代替）。經(jīng)過一定時間培養(yǎng)后，細菌懸浮液經(jīng)１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心５ ｍｉｎ后，取其上清液備用，空白對照也采用同樣的處理。所得溶液先在電爐上小火蒸發(fā)至近干，用硝酸消解、定容至５０ ｍＬ。用原子吸收分光光度法測定上清液中鎘的濃度。

菌株對培養(yǎng)液中有效鎘的吸附率＝（Ｃ０－Ｃｔ）／Ｃ０×１００％。式中，Ｃ０為對照的濃度（ｍｇ／Ｌ）；Ｃｔ為吸附后的上清液中鎘的濃度（ｍｇ／Ｌ）。

１．２．４耐鎘微生物對種子發(fā)芽率的影響試驗選用豌豆、花生、玉米、小麥和番茄種子，分別為５０、３０、５０、６０、５０粒。用無菌水制備各菌株的菌懸液，將各種種子浸泡于其中，時間為１０ ｍｉｎ，然后將晾干的種子分別放入鋪有用菌懸液濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，置于２８℃的恒溫箱中控溫作發(fā)芽試驗。每一品種均設(shè)置一個對照（以無菌水處理過的種子為對照）。

２結(jié)果與分析

２．１耐鎘微生物的篩選

鎘處理果園土壤經(jīng)系列梯度稀釋法分離獲得的土壤微生物在各培養(yǎng)基上的生長情況見表１。由表１可知，在２８℃的恒溫條件下培養(yǎng)１、２、７ ｄ后，含氯化鎘濃度０～０．５ ｍｇ／Ｌ的ＰＤＡ培養(yǎng)基上均有菌落（全部為細菌）出現(xiàn)。除此以外，經(jīng)恒溫培養(yǎng)７ ｄ后的含氯化鎘濃度４０．０、６０．０ ｍｇ／Ｌ的ＰＤＡ培養(yǎng)基上也均有少量的單個菌落（細菌）出現(xiàn)。分別選取氯化鎘濃度０．５、４０．０、６０．０ ｍｇ／Ｌ培養(yǎng)基上的單菌落，經(jīng)平板劃線法接種于ＰＤＡ培養(yǎng)基上觀察其培養(yǎng)性狀，所得菌株分別相應(yīng)命名為Ｃｄ－Ｒ－１、Ｃｄ－Ｒ－２和Ｃｄ－Ｒ－３。在２８℃恒溫條件下培養(yǎng)１２ ｈ后，各菌株的形態(tài)特征為：Ｃｄ－Ｒ－１為菌落乳白色，呈分枝狀，生長較快；Ｃｄ－Ｒ－２為菌落乳白色，較小，圓形或橢圓形，表面凸起；Ｃｄ－Ｒ－３為菌落乳白色，較大，圓形，表面凹陷。

２．２微生物耐鎘遺傳穩(wěn)定性分析

在２８℃恒溫培養(yǎng)條件下，將所獲得的３個耐鎘菌株Ｃｄ－Ｒ－１、Ｃｄ－Ｒ－２和Ｃｄ－Ｒ－３首先轉(zhuǎn)接于無鎘ＰＤＡ培養(yǎng)基上進行１０次傳代培養(yǎng)，然后再轉(zhuǎn)接于各菌株相應(yīng)含鎘（０．５、４０．０、６０．０ｍｇ／Ｌ）ＰＤＡ培養(yǎng)基上進行１０次傳代培養(yǎng)，試驗證實３個菌株在各種類型ＰＤＡ培養(yǎng)基（有鎘或無鎘）上均能生長。由此可見，３個菌株耐鎘性屬于遺傳性狀控制的特性，而不屬于隨環(huán)境變化而改變的表現(xiàn)型適應(yīng)的性狀。有區(qū)別的是３個菌株在含鎘ＰＤＡ培養(yǎng)基上生長較慢，菌落黏稠，灰白色。

２．３耐鎘微生物對鎘的吸附能力

經(jīng)過液體懸浮培養(yǎng)，３個菌株對培養(yǎng)液中有效鎘的吸附能力見圖１。由圖１可知，３個菌株對鎘的吸附率大小依次為Ｃｄ－Ｒ－１（７６．６％）、Ｃｄ－Ｒ－３（２９．６％）、Ｃｄ－Ｒ－２（２４．８％），相對于３個菌株的耐鎘性大?。郏茫洌遥常ǎ叮埃?ｍｇ／Ｌ）、Ｃｄ－Ｒ－２（４０．０ ｍｇ／Ｌ）、Ｃｄ－Ｒ－１（０．５ ｍｇ／Ｌ）］來說，耐低濃度鎘的菌株Ｃｄ－Ｒ－１表現(xiàn)出較強的鎘吸附性能。

２．４耐鎘微生物對種子發(fā)芽率的影響

控溫種子萌發(fā)試驗表明，各菌株菌懸液對不同種子發(fā)芽率的影響作用不同（表２）。由表２可知，耐鎘微生物對花生、小麥、番茄種子的發(fā)芽率沒有影響或影響不大；對玉米種子而言，Ｃｄ－Ｒ－１、Ｃｄ－Ｒ－２對種子發(fā)芽有明顯的促進作用，而Ｃｄ－Ｒ－３則影響不大。３個菌株處理后的豌豆種子發(fā)芽率遠低于對照，表明所得菌株對豌豆種子的發(fā)芽率有很強地抑制作用。

３討論

鎘污染對農(nóng)用土壤中微生物類群動態(tài)變化的影響是多樣的［１０－１２］，沈國清等［１３］報道１０ ｍｇ／ｋｇ土的鎘污染對土壤真菌、細菌和放線菌的毒理抑制作用大小依次為真菌＞細菌＞放線菌，而本試驗中所采用的是５０ ｍｇ／ｋｇ鎘馴化土壤來篩選耐鎘微生物，結(jié)果得到一些不同程度耐鎘微生物，且這些微生物均為細菌，未見有土壤真菌等，這與文獻［１２］報道的高濃度Ｃｄ對土壤真菌等的抑制作用大的結(jié)果基本相符。耐鎘微生物的平板篩選結(jié)果表明，恒溫培養(yǎng)７ ｄ后篩選得到的耐鎘微生物與培養(yǎng)１、２ ｄ后的結(jié)果有所差異，這或許是由培養(yǎng)基中鎘的誘導作用所導致，此結(jié)果相似于段學軍等［１４］利用ＤＧＧＥ方法對經(jīng)１．０ ｍｇ／ｋｇ鎘處理稻田土壤在第１周和第４周時間下土壤微生物的變化情況。

耐鎘遺傳穩(wěn)定性分析結(jié)果表明，３個耐鎘菌株Ｃｄ－Ｒ－１、Ｃｄ－Ｒ－２和Ｃｄ－Ｒ－３在無鎘和含鎘培養(yǎng)基上的培養(yǎng)性狀（菌落色澤和生長速度）有明顯區(qū)別。在菌落色澤方面，無鎘培養(yǎng)基上３個菌株菌落色澤呈現(xiàn)乳白色，而在相應(yīng)濃度含鎘培養(yǎng)基上，３個菌株菌落色澤呈現(xiàn)灰白色，說明鎘的存在至少影響了這些菌株的某些外泌色素的產(chǎn)生，與劉愛民等［８］報道的抗Ｃｄ細菌Ｊ５在大于１２ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｃｄ２＋濃度的情況下，細菌色素產(chǎn)生受抑制的現(xiàn)象一致；在生長速度方面，同樣的培養(yǎng)條件下，無鎘培養(yǎng)基上３個菌株菌落出現(xiàn)所需時間短（約１２ ｈ），而在含鎘培養(yǎng)基上菌落的出現(xiàn)則需２４ ｈ以上，生長速度的減慢最終體現(xiàn)在細胞內(nèi)各種物質(zhì)（可溶性蛋白、可溶性糖和核酸等）的質(zhì)量濃度的減小，以增強細胞對鎘脅迫的適應(yīng)力［１５］。

耐鎘微生物對鎘的吸附能力試驗結(jié)果表明，耐鎘性較強的菌株Ｃｄ－Ｒ－３對有效鎘的吸附能力卻表現(xiàn)一般，而耐鎘性較弱的菌株Ｃｄ－Ｒ－１卻表現(xiàn)出較強的吸附能力，造成這種現(xiàn)象的原因或許與吸附試驗中培養(yǎng)液中的菌體濃度［６］、溶液ｐＨ值［１６，１７］、有效鎘濃度［１６］、溶質(zhì)類型［１８］等有關(guān)。

種子萌發(fā)率試驗結(jié)果表明，從自然界土壤中篩選到的耐鎘微生物，并不是適合于任何類型農(nóng)作物土壤污染的生物修復，首先必須考慮測試所得微生物是否會對農(nóng)田作物產(chǎn)生負作用，否則就不能加以使用。

本研究是用所采果園土壤經(jīng)過鎘強化脅迫來篩選耐鎘性土壤微生物，以期得到耐鎘性較強、吸附性能好的土壤微生物用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中鎘污染土壤的生物修復；但研究證實即使獲得耐鎘性較強的菌株，要想達到最大程度的生物修復作用，還必須綜合考慮其他眾多因素，如作物類型、土壤理化性狀（有機質(zhì)、全氮、堿解氮、速效磷、速效鉀、ｐＨ值）等。

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