纖維素降解菌系的篩選及降解稻草條件研究

摘要：以已分離的１１株纖維素降解菌為材料，采用濾紙崩解法和透明圈法，初步篩選出４株纖維素降解能力較強(qiáng)的菌株。將這４株單菌進(jìn)行兩兩組合，研究混合菌系在９ｄ內(nèi)的ＣＭＣ酶活和ＦＰＡ酶活與單菌發(fā)酵之間的異同。結(jié)果表明，混合菌發(fā)酵ＣＭＣ酶活和ＦＰＡ酶活均優(yōu)于單一菌株；同時(shí)篩選出一組具有高降解能力的混合菌體系；并對該混合菌系降解稻草的最適反應(yīng)溫度、最適初始ｐＨ值、產(chǎn)生還原糖的時(shí)間進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，在３０℃、ｐＨ值４．５、發(fā)酵９６ ｈ時(shí)混合菌降解稻草的效果最好。

關(guān)鍵詞：纖維素降解菌；篩選；ＣＭＣ酶活；ＦＰＡ酶活；還原糖含量；降解條件

中圖分類號(hào)：Ｑ９３－３３１文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ文章編號(hào)：0439－８114（２０11）03－0490-03

Screening of Cellulose Degrading Microorganism and the Degrading Condition of

Rice Straw

ＹＡＮＧ Ｙａ－ｚｈｅｎａ，ＭＡ Ｌｉ－ａｎａ，ＺＨＡＮＧ Ｊｉａｎ－ｍｉｎｂ，ＧＡＯ Ｚｈａｎ－ｘｉａｎｇａ，ＤＯＮＧ Ｓｈｅ－ｑｉｎａ

（Ｙａｎgｔｚｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， ａ．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ； ｂ．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Agronomy， Ｊｉｎｇｚｈｏｕ ４３４０２５， Ｈｕｂｅｉ， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｆｏｕｒ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｉｔｈ ｓｔｒｏｎｇ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ａｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｗｅｒｅ ｓｃｒｅｅｎｅｄ ｏｕｔ of 11 ｂａｃｔｅｒｉａ ｕｓｉｎｇ ｆｉｌｔｅｒ ｐａｐｅｒ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｃｌｅａｒ ｈａｌｏ ｍｅｔｈｏｄ． Ｔｈｅｎ ａ ｍｉｘｅｄ ｇｅｒｍ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈｅｒ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ａｂｉｌｉｔｙ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ as ｔｈｅ ＣＭＣ ａｎｄ ＦＰＡ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｍｉｘｅｄ ｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｄ ｐｕｒｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｗａｓ ｃｏｍｐａｒｅｄ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｘｅｄ ｇｅｒｍ ｔｏ ｒｉｃｅ ｓｔｒａｗ ｗａｓ ３０℃， ｐＨ ４．５， ａｎｄ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｆｏｒ ９６ ｈ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ； ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ； ＣＭＣ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ； ＦＰＡ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ； dｅｇｒａｄｉｎｇ cｏｎｄｉｔｉｏｎ

纖維素是地球上最廉價(jià)、最豐富的可再生資源。全世界每年纖維素及半纖維素的生成量為８５０億ｔ。利用微生物產(chǎn)生的纖維素酶來分解和轉(zhuǎn)化纖維素是纖維素利用的有效途徑。纖維素的生物降解對開辟新能源和防止其污染環(huán)境有重要意義，一直是生物技術(shù)領(lǐng)域的研究重點(diǎn)［１，２］。在長期生產(chǎn)實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)該生物過程是微生物單獨(dú)作用不能完成或只能微弱進(jìn)行的，必須依靠兩種或兩種以上的微生物共同作用才能完成，微生物混合培養(yǎng)或混合發(fā)酵已越來越受重視［３］。而且國內(nèi)對產(chǎn)纖維素酶能力較強(qiáng)的單一菌種研究較多，菌種混合發(fā)酵的研究較少［４，５］。本試驗(yàn)在纖維素降解單一菌株研究的基礎(chǔ)上，著力于篩選降解纖維素的混合菌系，旨在為纖維素的高效轉(zhuǎn)化提供依據(jù)。

１材料與方法

１．１菌種

纖維素降解菌分別來自枯樹根、爛菜葉、牛糞和牛胃中。

１．２培養(yǎng)基制備

ＰＤＡ培養(yǎng)基：馬鈴薯２００ ｇ，蔗糖２０ ｇ，瓊脂粉２０ ｇ，水１ ０００ ｍＬ，ｐＨ值６．５。濾紙條鑒定培養(yǎng)基：（ＮＨ４）２ＳＯ４ ０．１０％， ＫＨ２ＰＯ４ ０．１０％， ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．０５％，Ｋ２ＨＰＯ４ ０．２０％，酵母膏０．０１％，濾紙條（規(guī)格為１ ｃｍ×７ ｃｍ）１塊，ｐＨ值６．５。纖維素剛果紅培養(yǎng)基：（ＮＨ４）２ＳＯ４ ０．２０％，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．０５％，ＫＨ２ＰＯ４ ０．１０％，ＮａＣｌ ０．０５％，ＣＭＣ－Ｎａ ２．００％，剛果紅０．０２％，瓊脂２．００％，ｐＨ值６．５。液體發(fā)酵培養(yǎng)基：ＫＨ２ＰＯ４ １．００ ｇ， ＮａＣｌ ０．１０ ｇ， ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．３０ ｇ， ＮａＮＯ３ ２．５０ ｇ， ＦｅＣｌ３ ０．０１ ｇ，ＣａＣｌ２ ０．１０ ｇ，秸稈木質(zhì)纖維素 ２０．００ ｇ，ｐＨ值７．２０～７．４０。

１．３菌種初篩

透明圈直徑（Ｈ）與菌落直徑（Ｄ）比值的測定：將１１株保藏菌種（菌種名稱分別為Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８、Ｎ９、Ｎ１０、Ｎ１１）活化后分別接種到ＰＤＡ培養(yǎng)基上，３０℃培養(yǎng)３ｄ。將每一株菌分別轉(zhuǎn)接到纖維素剛果紅培養(yǎng)基上，３０℃培養(yǎng)４ ｄ后，加入適量1 ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＣｌ溶液，浸泡1 ｈ，根據(jù)Ｈ與Ｄ比值的大小進(jìn)行初篩。

單菌株濾紙失重率的測定：將透明圈大的菌種接種于濾紙條鑒定培養(yǎng)液中，以不接種處理作對照，２８℃搖床培養(yǎng)８ ｄ，分別在２、４、６、８ ｄ時(shí)測其失重率。濾紙失重率的測定：用濾紙過濾發(fā)酵液，將殘留物８０℃烘干稱重，用減重法計(jì)算出濾紙失重率。失重率＝（培養(yǎng)前底物干重－培養(yǎng)后底物干重）×１００％／培養(yǎng)前底物干重。

將單菌株濾紙失重率較大且Ｈ／Ｄ值大于２．０的菌株作為復(fù)篩菌種。

１．４復(fù)篩

將初篩所得單菌種進(jìn)行兩兩組合，對單菌種和不同組合菌種測定羧甲基纖維素酶活和濾紙酶活。以體積比為１∶１的接種比例、１０％的接種量分別接入固態(tài)培養(yǎng)基中。

１．４．１羧甲基纖維素酶活測定①酶液的制備：將發(fā)酵液于４ ０００ ｒ／ｍｉｎ，４℃，離心２０ ｍｉｎ，取上清液，備用。②纖維素酶活力的測定方法（ＤＮＳ法）：?。痢ⅲ?、Ｃ共３支５０ ｍＬ比色管，在Ａ、Ｂ管中分別加入１．５、０．５ ｍＬ的1％ ＣＭＣ－Ｎａ溶液（用ｐＨ值４．８的醋酸－醋酸鈉緩沖液配制）適當(dāng)稀釋的酶液， Ｃ管中加入１．５ ｍＬ的ｐＨ值為４．８的醋酸－醋酸鈉緩沖液和０．５ ｍＬ酶液，５０℃下保溫３０ ｍｉｎ，然后在３支比色管中分別加入２．５ ｍＬ的ＤＮＳ試劑，沸水浴５ ｍｉｎ后放入水中冷卻，終止反應(yīng)，定容至２５ ｍＬ，搖勻，在波長５２０ ｎｍ處測定吸光值（Ｃ管作空白對照），并從葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的葡萄糖含量，再折算成酶活力單位。ＣＭＣ酶活力定義為：在ｐＨ值４．８，５０℃條件下，１ ｍＬ酶液每分鐘水解羧甲基纖維素鈉生成１ μｇ葡萄糖的酶量，稱為一個(gè)酶活力單位，以Ｕ／ｍＬ表示。

１．４．２濾紙酶活（ＦＰＡ）測定取Ａ、Ｂ、Ｃ共３支具塞比色管，在Ａ、Ｂ管中加入ｐＨ值４．８醋酸－醋酸鈉緩沖液１．５ ｍＬ和１ ｃｍ×６ ｃｍ規(guī)格的新華濾紙條（約５０ ｍｇ），５０℃下預(yù)熱１０ ｍｉｎ后，加入０．５ ｍＬ適當(dāng)稀釋的酶液，Ｃ管不加底物作空白對照，５０℃下保溫６０ ｍｉｎ，然后在３支比色管中分別加入２．５ ｍＬ ＤＮＳ試劑，沸水?。?ｍｉｎ后立即在水中冷卻，終止反應(yīng)，定容至２５ ｍＬ，搖勻，在波長５２０ ｎｍ處測定吸光值（Ｃ管作空白對照），根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶活力。酶活力定義為：在ｐＨ值４．８，５０℃條件下， 1 ｍＬ酶液每分鐘水解濾紙條生成１μｇ葡萄糖的酶量，稱為一個(gè)酶活力單位，以Ｕ／ｍＬ表示。

１．５菌種降解稻草條件研究

還原糖含量測定按照ＤＮＳ比色法［６］進(jìn)行。

２結(jié)果與分析

２．１初篩結(jié)果

由經(jīng)過活化的１１株菌株在剛果紅培養(yǎng)基上的生長情況（表１）可知，菌株Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ７、Ｎ８和Ｎ９的濾紙失重率相對較高；從透明圈與菌落圈直徑之比來看，菌株Ｎ１、Ｎ３、Ｎ７、Ｎ８的Ｈ／Ｄ都超過２．０。因此，選?。危?、Ｎ３、Ｎ７、Ｎ８號(hào)菌株作為復(fù)篩對象。

２．２復(fù)篩結(jié)果

發(fā)酵過程中菌系ＣＭＣ酶活的變化情況見表２。由表２可知，接種后１～２ ｄ內(nèi)酶活逐漸上升，大部分菌株在３～４ ｄ時(shí)酶活出現(xiàn)最高峰值，５～６ ｄ酶活開始下降，７～９ ｄ酶活又緩慢上升。兩種菌株混合培養(yǎng)在一定程度上會(huì)提高ＣＭＣ酶活，組合菌株Ｎ７＋Ｎ８培養(yǎng)４ ｄ時(shí)的ＣＭＣ酶活為１９５．７Ｕ／ｍＬ，相當(dāng)于其菌株單獨(dú)培養(yǎng)平均酶活的２．３６倍。

表３表示的是濾紙酶活在發(fā)酵過程中的變化情況，總體的變化趨勢是在１～４ ｄ內(nèi)先上升，５～７ ｄ上升到峰值，之后再下降。兩種菌混合培養(yǎng)時(shí)ＦＰＡ酶活也有一定程度的提高，組合菌株Ｎ７＋Ｎ８在發(fā)酵６ｄ時(shí)的ＦＰＡ酶活為３０．５ Ｕ／ｍＬ，相當(dāng)于其菌株單獨(dú)培養(yǎng)平均酶活的１．７倍。因此，選取組合Ｎ７＋Ｎ８作為最優(yōu)纖維素降解混合菌系。

２．３組合菌株Ｎ７＋Ｎ８降解稻草的最適溫度

分別研究了溫度在２０、３０、４０、５０、６０℃時(shí)混合菌降解稻草后的ＣＭＣ酶活、ＦＰＡ酶活、產(chǎn)還原糖量（表４）。由表４可知，ＣＭＣ酶活、ＦＰＡ酶活、還原糖含量三者之間存在較明顯的正相關(guān)性，三者均在溫度為３０℃時(shí)達(dá)到最大值。因此選擇３０℃作為混合菌降解稻草的最適溫度。

２．４組合菌株Ｎ７＋Ｎ８降解稻草的最適ｐＨ值

分別研究了初始ｐＨ值為４．０、４．５、５．０、５．５和６．０時(shí)混合菌降解稻草后的ＣＭＣ酶活、ＦＰＡ酶活、還原糖量。由表５可知，初始ｐＨ值為４．５時(shí)，ＣＭＣ酶活、ＦＰＡ酶活、還原糖含量三者均達(dá)到最大值。因此選擇４．５為混合菌降解稻草的最適初始ｐＨ值。

２．５組合菌株Ｎ７＋Ｎ８降解稻草的最適培養(yǎng)時(shí)間

在混合菌降解稻草的最優(yōu)發(fā)酵條件下，每隔１２ ｈ測定１次其生長狀況及產(chǎn)糖情況，研究培養(yǎng)時(shí)間對混合菌生長及產(chǎn)還原糖的影響，結(jié)果見圖1。由圖1可知，混合菌系在培養(yǎng)７２ ｈ之前，還原糖產(chǎn)量較低，在培養(yǎng)７２～９６ ｈ過程中，混合菌系迅速產(chǎn)生還原糖，在９６ ｈ時(shí)還原糖產(chǎn)生量最高，達(dá)１．８ ｇ／Ｌ。

３討論

本研究篩選出了一組具有較高纖維素降解活力的混合菌系，該混合菌系的ＣＭＣ酶活和濾紙酶活均高于單一菌株；同時(shí)研究了該混合菌系降解稻草的最適反應(yīng)溫度、最適初始ｐＨ值及培養(yǎng)時(shí)間對還原糖量的影響。本研究雖對上述試驗(yàn)條件進(jìn)行了探討，但以下問題有待進(jìn)一步研究：①所得混合菌系纖維素降解酶活力距離生產(chǎn)要求還有很大的差距，應(yīng)采用誘變等方法對該菌系進(jìn)行處理，以提高現(xiàn)有菌系的產(chǎn)酶活力；②在利用單因素法研究溫度、ｐＨ值、培養(yǎng)時(shí)間對產(chǎn)酶的影響的基礎(chǔ)上，需進(jìn)一步研究多因素對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響，以使理論研究更加貼近實(shí)際生產(chǎn)。

參考文獻(xiàn)：

［１］ ＭＡＮＤＥＬＳ Ｍ， ＳＴＥＲＮＢＥＲＧ Ｄ． Ｒｅｃｅｎｔ ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ［Ｊ］． Ｊ Ｆｅｒｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌ，１９７６，５４（４）：２６７－２８６．

［２］ ＨＡＲＵＴＡ Ｓ，ＣＵＩ Ｚ，ＨＵＡＮＧ Ｚ，ｅｔ ａｌ． Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｔａｂｌｅ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ－ｄｅｇｒａ－ｄａｔｉｏｎ ａｂｉｌｉｔｙ［Ｊ］． Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００２，５９（４－５）：５２９－５３４．

［３］ 馮樹，周櫻橋，張忠澤． 微生物混合培養(yǎng)及其應(yīng)用［Ｊ］ ．微生物學(xué)通報(bào)，２００１，２８（３）：９２－９５．

［４］ 史玉英，沈其榮，婁無忌，等． 纖維素分解菌的分離和篩選［Ｊ］． 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，１９９６，１９（３）：５９－６２．

［５］ 洪洞，黃秀莉． 纖維素酶的應(yīng)用［Ｊ］．生物學(xué)通報(bào)，１９９７，３２（１２）：１８－１９．

［６］ 王玉萬，徐文玉． 木質(zhì)纖維素固體基質(zhì)發(fā)酵物中半纖維素、纖維素和木質(zhì)素的定量分析程序［Ｊ］．微生物學(xué)通報(bào)，１９８７，１４（２）：８１－８４．